新型噻唑烷二酮衍生物的合成及其抑制酪氨酸酶活性研究

张 宇, 刘进兵

(邵阳学院 食品与化学工程学院，湖南 邵阳 422000)

酪氨酸酶是含铜离子的多酚氧化酶，广泛存在于微生物和动植物中，在酪氨酸转化为多巴醌的过程中起催化作用。因此，酪氨酸酶对黑色素的合成有重要作用[1-2]。酪氨酸酶是导致果蔬发生酶促褐变的关键酶。果蔬褐变会对蔬果的外观、品质及营养价值产生不利影响。酪氨酸酶也是人体中黑色素合成的关键限速酶。黑色素可以防紫外辐射，但酪氨酸酶过量表达会引起黄褐斑、雀斑等。此外，昆虫的生长发育、伤口愈合以及角质层的形成与酪氨酸酶也有重要联系[3-8]。近年来，关于酪氨酸酶抑制剂的报道较多[9]，但具有应用价值的抑制剂较少，高效低毒的酪氨酸酶抑制剂具有广阔的市场前景。

噻唑是一类重要的含氮硫五元杂环化合物，包含噻唑环结构的杂环化合物为药物分子设计的重要先导化合物之一[10]。噻唑衍生物具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化、消炎、抑制酪氨酸酶等多种生物活性[11-13]。

为了开发新型高效低毒酪氨酸酶抑制剂，本文在课题组前期研究的基础上，以噻唑烷二酮和取代芳香醛为原料，通过缩合反应合成了一系列新型噻唑烷二酮衍生物(1～11, Scheme 1)，其结构经1H NMR、13C NMR、 IR、 MS(ESI)和元素分析表征。考察了1～11对酪氨酸酶的抑制活性，并选择化合物8进行了抑制动力学和分子对接研究。

Scheme 1

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

SGW-X4型熔点仪；UV-2600型紫外分光光谱仪；Bruker 300/400 MHz型核磁共振仪(TMS为内标)；Nicolet-iS5型红外光谱仪；LCMS- 2010A型质谱仪；Euro EA型元素分析仪。

酪氨酸酶、L-多巴、曲酸、1,1-二苯基-2-苦基苯肼自由基(DPPH)、 2,2′-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)， Sigma-Aldrich；其余所用试剂均为分析纯。

1.2 1～11的合成通法

称取噻唑烷-2,4-酮6 mmol，加入50 mL反应瓶中，加入20 mL乙醇、5 mL三乙胺(或哌啶)，搅拌下加入5 mmol取代芳香醛，于80 ℃回流反应至终点(薄层色谱跟踪，展开剂：石油醚/乙酸乙酯=2/1,V/V)。冷却至室温，加入10 mL水，析出沉淀，抽滤，滤饼用蒸馏水洗涤3次，粗产品经硅胶柱层析纯化得目标产物。

5-苯亚甲基-2,4-噻唑烷二酮(1)： 黄色固体，收率59.51%， m.p.218.6～219.3 ℃；1H NMRδ: 12.65(s, 1H, -NH), 7.80(s, 1H, =CH), 7.60(d,J=8.0 Hz, 2H, Ph-H), 7.56～7.45(m, 3H, Ph-H);13C NMRδ: 168.3, 167.7, 133.4, 132.2, 130.8, 130.4, 129.7, 123.9; IRν: 3032, 1736, 1685, 1349, 826, 760, 650 cm-1; MS(ESI)m/z: 206{[M+H]+}; Anal. Calcd for C10H7NO2S: C 58.52, H 3.44, N 6.82, found C 58.54, H 3.41, N 6.85。

5-(3-氯苯亚甲基)-2,4-噻唑烷二酮(2)： 黄色固体，收率27.17%， m.p.223.5～225.7 ℃;1H NMRδ: 7.77(s, 1H, =CH), 7.68(s, 1H, Ph-H), 7.56～7.53(m, 3H, Ph-H);13C NMRδ: 167.8, 167.6, 135.3, 133.9, 131.1, 129.9, 129.8, 129.7, 127.7, 125.8; IRν: 1671, 1313, 1281, 1158, 781, 684, 681 cm-1; MS(ESI)m/z: 240{[M+H]+}; Anal. Calcd for C10H6NO2SCl: C 50.11, H 2.52, N 5.84, found C 50.12, H 2.55, N 5.81。

5-(2,4-二氯苯亚甲基)-2,4-噻唑烷二酮(3)： 黄色固体，收率26.5%， m.p.241.7～243.2 ℃;1H NMRδ: 12.82(s, 1H, -NH), 7.85(s, 1H, =CH), 7.63～7.55(m, 3H, Ph-H);13C NMRδ: 167.8, 167.6, 135.3, 133.9, 131.1, 129.9, 129.8, 129.7, 127.7, 125.8; IRν: 1698, 1463, 1338, 1146, 806, 715, 618 cm-1; MS(ESI)m/z: 275{[M+H]+}; Anal. Calcd for C10H5NO2SCl2: C 43.81, H 1.84, N 5.11, found C 43.85, H 1.82, N 5.13。

5-(3,4-二氯苯亚甲基)-2,4-噻唑烷二酮(4)： 黄色固体，收率23.40%， m.p.>280 ℃;1H NMRδ: 7.84(s, 1H, =CH), 7.63(d,J=8.7Hz, 1H, Ph-H), 7.60(s, 1H, Ph-H), 7.58(d,J=8.7Hz, 1H, Ph-H);13C NMRδ: 167.6, 167.3, 135.33, 135.31, 130.1, 129.9, 129.8, 128.3, 128.2, 125.2; IRν: 1697, 1557, 1321, 1108, 866, 786, 688 cm-1; MS(ESI)m/z: 275{[M+H]+}; Anal. Calcd for C10H5NO2SCl2: C 43.81, H 1.84, N 5.11, found C 43.83, H 1.81, N 5.11。

5-(3-羟基苯亚甲基)-2,4-噻唑烷二酮(5)： 黄色固体，收率33.09%， m.p.267.6～269.7 ℃;1H NMRδ: 12.61(s, 1H, -NH), 9.85(s, 1H, OH), 7.70(s, 1H, =CH), 7.36(t,J=8.1 Hz, 1H, Ph-H), 7.05(d,J=8.1 Hz, 1H, Ph-H), 6.99(s, 1H, Ph-H), 7.91(d,J=8.1 Hz, 1H, Ph-H);13C NMRδ: 167.9, 167.3, 157.8, 134.1, 132.0, 130.3, 123.2, 121.3, 117.7, 115.9; IRν: 1698, 1450, 1305, 1167, 857, 793, 635 cm-1; MS(ESI)m/z: 220{[M-H]-}; Anal. Calcd for C10H7NO3S: C 54.29, H 3.19, N 6.33, found C 54.27, H 3.16, N 6.36。

5-(4-羟基苯亚甲基)-2,4-噻唑烷二酮(6)： 黄色固体，收率39.91%，m.p.299.1～299.7 ℃;1H NMRδ: 12.47(s, 1H, -NH), 10.33(s, 1H, OH), 7.71(s, 1H, =CH), 7.47(d,J=8.7 Hz, 2H, Ph-H), 6.94(d,J=8.7 Hz, 2H, Ph-H);13C NMRδ: 168.0, 167.5, 159.9, 132.4, 132.3, 123.9, 118.9, 116.3. IRν: 3400, 1672, 1570, 1508, 1338, 1154, 823, 739, 695 cm-1; MS(ESI)m/z: 220{[M-H]-}; Anal. Calcd for C10H7NO3S: C 54.29, H 3.19, N 6.33, found C 54.30, H 3.19, N 6.31。

5-(3,4-二羟基苯亚甲基)-2,4-噻唑烷二酮(7)： 黄色固体，收率41.32%，m.p.>280 ℃;1H NMRδ: 12.34(s, 1H, -NH), 10.46(s, 1H, OH), 10.19(s, 1H, OH), 7.99(s, 1H, =CH), 7.19(d,J=8.1Hz, 1H, Ph-H), 6.43(d,J=8.1Hz, 1H, Ph-H), 6.39(s, 1H, Ph-H);13C NMRδ: 168.3, 167.7, 161.6, 159.4, 129.9, 127.4, 116.8, 111.6, 108.3, 102.5; IRν: 1674, 1533, 1347, 1150, 848, 755, 690 cm-1; MS(ESI)m/z: 236{[M-H]-}; Anal. Calcd for C10H7NO4S: C 50.63, H 2.97, N 5.90, found C 50.65, H 2.94, N 5.92。

5-(4-羟基-3-甲氧基苯亚甲基)-2,4-噻唑烷二酮(8)： 黄色固体，收率26.70%， m.p.>280 ℃;1H NMRδ: 7.37(s, 1H, =CH), 7.13(s, 1H, Ph-H), 7.02(d,J=8.4Hz, 1H, Ph-H), 6.88(d,J=8.4Hz, 1H, Ph-H), 3.81(s, 3H, -OCH3);13C NMRδ: 179.1, 174.0, 147.7, 128.9, 126.4, 125.6, 123.0, 118.7, 115.8, 113.1, 55.5; IRν: 1674, 1577, 1287, 1137, 831, 789, 675 cm-1; MS(ESI):m/z(100%) 250{[M-H]-}; Anal. Calcd for C11H9NO4S: C 52.58, H 3.61, N 5.57, found C 52.57, H 3.65, N 5.55。

5-(3-羟基-4-甲氧基苯亚甲基)-2,4-噻唑烷二酮(9)： 黄色固体，收率22.47%， m.p.201.5～203.2 ℃;1H NMRδ: 12.47(s, 1H, -NH), 9.96(s, 1H, OH), 7.72(s, 1H, =CH), 7.17(d,J=8.0 Hz, 1H, Ph-H), 7.07(m, 1H, Ph-H), 6.94(d,J=8.1 Hz, 1H, Ph-H), 6.92(d,J=8.1 Hz, 1H, Ph-H), 3.83(s, 3 H,-OCH3);13C NMRδ: 168.5, 167.9, 149.9, 148.4, 133.1, 124.8, 124.6, 119.6, 116.6, 114.5; IRν: 3338, 3041, 1733, 1674, 1592, 1272, 788, 766, 690 cm-1; MS(ESI)m/z: 250{[M-H]-}; Anal. Calcd for C11H9NO4S: C 52.58, H 3.61, N 5.57, found C 52.57, H 3.63, N 5.55。

5-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯亚甲基)-2,4-噻唑烷二酮(10)： 黄色固体，收率60.93%， m.p.224.3～226.8 ℃;1H NMRδ: 12.53(s, 1H, NH), 9.36(s, 1H, OH), 7.71(s, 1H, =CH), 6.89(s, 2H, Ph-H), 3.82(s, 6H, OCH3);13C NMRδ: 168.4, 167.8, 148.6, 139.0, 133.3, 123.7, 120.2, 108.4; IRν: 3595, 3512, 2991, 1719, 1676, 1117, 824, 719, 674 cm-1; MS(ESI)m/z: 280{[M-H]-}; Anal. Calcd for C12H11NO5S: C 51.24, H 3.94, N 4.98, found C 51.26, H 3.93, N 4.97。

5-(3,4,5-三甲氧基苯亚甲基)-2,4-噻唑烷二酮(11)： 黄色固体，收率26.57%， m.p.173.7～174.5 ℃;1H NMRδ: 12.60(s, 1H, -NH), 7.74(s, 1H, =CH), 6.91(s, 2H, Ph-H), 3.83(s, 6H, OCH3), 3.32(s, 3H, OCH3);13C NMRδ: 168.3, 167.8, 153.6, 139.8, 132.5, 129.0, 122.9, 107.9; IRν: 3171, 1741, 1607, 1311, 998, 790, 621 cm-1; MS(ESI)m/z: 296{[M+H]+}; Anal. Calcd for C13H13NO5S: C 52.87, H 4.44, N 4.74, found C 52.90, H 4.47, N 4.76。

1.3 抑制酪氨酸酶活性、抑制动力学和分子对接

按文献[14-15]方法测试化合物的酪氨酸酶抑制活性和抑制动力学；按文献[16]方法进行分子对接研究。

2 结果与讨论

2.1 抑制酪氨酸酶活性

以L-多巴为底物，曲酸为阳性对照，对合成的11个化合物进行了抑制酪氨酸酶活性研究，结果见表1。

表1 化合物1～11对酪氨酸酶的抑制作用

由表1可知，所有噻唑烷二酮衍生物具有一定的抑制酪氨酸酶活性，IC50值为0.12±0.03 μM～30.11±0.27 μM，部分化合物的抑制活性优于阳性对照曲酸。化合物8抑制活性最好，IC50值为0.12±0.03 μM。取代基是影响抑制活性的重要因素，化合物2比化合物1的抑制活性好，因此氯原子取代氢原子可能是提高活性的有利因素。然而，对比化合物3、4和化合物2的活性可以发现，氯原子数目的增加，活性反而下降，这说明抑制活性与氯原子的位置及数目有关。具有4-羟基结构的化合物(6)具有一定的抑制酪氨酸酶活性，其抑制活性强于有3-羟基结构的化合物(5)。因此，羟基在苯环上的位置也是影响抑制活性因素之一，羟基在对位可能更有利于与酪氨酸酶活性中心或氨基酸残基相互作用。具有3,4-二羟基结构化合物(7)抑制酪氨酸酶活性不如化合物(6)，这进一步说明了取代基位置和数目对抑制活性有重要影响。具有4-羟基苯基结构的化合物(8)抑制活性强于具有3-羟基苯基结构的化合物(9)，同样说明了羟基在4-羟基对提高抑制活性更有利。

2.2 抑制动力学

在所合成的化合物中，化合物8抑制酪氨酸酶的活性强于其他化合物，为了进一步探讨抑制机理和抑制类型，优选该化合物进行抑制动力学研究。通过不同浓度抑制剂作用下的酶促反应速率vs底物浓度的双倒数曲线来确定抑制类型。如图1所示，得到了一组具有不同斜率的直线，斜率随着抑制剂的浓度降低而下降，所有直线交于Y轴上，这就表明化合物8为竞争性抑制剂，其抑制常数Ki为0.54 μM。

1/[S](mM)-1A

2.3 分子对接

通过计算机模拟计算抑制剂与酪氨酸酶的亲和力，结合能越小说明配体与目标蛋白形成的配合物越稳定。化合物8的结合能为-6.22 kcal/mol，小于阳性对照曲酸的结合能(-5.7 kcal/mol)。因此，化合物8能够与酪氨酸酶形成更稳定的配合物。如图2所示，化合物8的苯环上4-羟基可以和酪氨酸酶的铜离子活性中心相互作用，说明4-羟基可能是其活性中心。化合物8的甲氧基可与Asn260形成氢键，噻唑环可分别与Val283和Ser282形成氢键。

图2 化合物8的分子对接图

合成了11个噻唑烷二酮衍生物，考察了其对酪氨酸酶的抑制活性。结果表明，所有化合物均有一定的抑制酪氨酸酶活性，其中化合物8抑制活性最好，其IC50值为0.12±0.03 μM。抑制动力学研究表明化合物8为竞争性抑制剂，其抑制常数Ki为0.54 μM。分子对接结果显示化合物8的酚羟基可以与酪氨酸酶铜离子活性中心相关作用，甲氧基能够与Asn260形成氢键，噻唑环能够与Ser282、 Val283形成氢键。初步构效关系分析表明：苯环上氯原子位置和数目能够调节抑制酪氨酸酶活性；苯环上羟基位置对抑制活性有影响，4-羟基更有利于提高抑制活性。化合物8可以作为设计新型酪氨酸酶抑制剂的先导化合物。