高原毛茛总黄酮含量测定及提取工艺研究

王晚翠，马 倩，暨迪军，刘明珠，卢永昌

（青海民族大学药学院/青海省青藏高原植物资源化学研究重点实验室/青海省药物分析重点实验室/青海省现代藏药创制工程技术研究中心，西宁 810007）

高原毛茛（Ranunculusbrotherusii）为毛茛目被子植物，多年生草本，生于海拔3 000～4 500 m的山坡或沟边沼泽湿地，分布于西藏、云南西北部、四川西部、陕西、甘肃、青海、山西及河北等地区。尼泊尔、印度北部也有分布。全草药用，有清热解毒之效，治淋巴结核等症，消炎退肿，平喘，截疟，用于感冒，瘰疬。外用于牛皮癣。藏药名杰察，辛，温，有小毒［1，2］。常用于提升胃温，愈疮，引黄水，用于收敛溃烂喉症，腹水，黄水病，头昏胀以及寒性肿瘤。黄酮类化合物是一类植物次生代谢产物，在多种植物中均有分布，具有抗氧化、抑菌［3］、防止血管增生、抗病毒、降血糖、降血脂、抗骨质疏松等多种生物活性［4］。

1 材料与方法

1.1 药材

高原毛茛于2019年8月采自青海玉树。经青海民族大学卢永昌教授鉴定为高原毛茛，标本存于青海民族大学药学院标本室。

1.2 仪器

T6紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；HH-6恒温水浴锅，金坛市杰瑞尔电器有限公司；ME2353电子天平，北京赛多利斯仪器有限公司；超声清洗仪，昆山洁力美超声仪器有限公司；SHB-B88循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司。

1.3 试剂

芦丁对照品，都莱生物有限公司，批号：N1811260038；氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、乙醇均为分析纯。

1.4 方法

1.4.1 对照品溶液的制备 准确称量芦丁标准品20.1 mg，置于50 mL容量瓶中，加入适量60%乙醇溶液，超声至完全溶解呈澄清透明状，继续用60%乙醇溶液定容至刻度线，即得到质量浓度为0.402mg/mL的芦丁标准品溶液［5］。

1.4.2 供试品溶液的制备 准确称取高原毛茛1.0 g，置于锥形瓶中，加入60%乙醇溶液45 mL，称定质量，超声提取1.0 h，冷却至室温，称定质量，用60%乙醇溶液补足缺失的质量，过滤，取续滤液，做为供试品溶液备用［6］。

1.4.3 标准曲线的绘制 准确吸取芦丁对照品溶液0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL于25 mL容量瓶中，加入1.00 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀，静置6 min；加入1.00 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀，静置6 min，加入4%氢氧化钠溶液10.00 mL，摇匀，用60%乙醇溶液定容，摇匀，静置15 min。按照顺序向60%乙醇溶液中加入亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠，作为空白溶液，在510 nm处测定各个溶液的吸光度。以芦丁标准品溶液的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，其线性回归方程为Y=12.754X+0.022 9（r=0.999 6）［7］。

1.4.4 单因素试验考察

1）提取方法对总黄酮含量的影响。分别称取4份高原毛茛，每份1.0 g，各加入40 mL 60%乙醇溶液，分别采用浸提法、超声法、煎煮法、热回流法提取1.0 h，过滤后用紫外分光光度计测定滤液吸光度，并计算其总黄酮含量。

2）提取时间对总黄酮含量的影响。分别准确称取5份高原毛茛，每份1.0 g，置于锥形瓶中，各加入40 mL 60%乙醇溶液，使用超声提取法分别提取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，过滤后用紫外分光光度计测定滤液吸光度，并计算其总黄酮含量。

3）料液比对总黄酮含量的影响。分别准确称取5份高原毛茛，每份1.0 g，置于锥形瓶中，设置料液比分别为1∶15、1∶25、1∶35、1∶45、1∶55，60%乙醇溶液作为溶剂，超声提取法提取1.5 h，过滤后用紫外分光光度计测定滤液吸光度，并计算其总黄酮含量。

4）乙醇体积分数对总黄酮含量的影响。分别准确称取5份高原毛茛，每份1.0 g，置于锥形瓶中，分别加入40 mL 40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，超声提取法提取1.0 h，过滤后用紫外分光光度计测定滤液吸光度，并计算其总黄酮含量。

1.4.5 正交试验 通过对不同提取方法、不同提取时间、不同料液比及不同乙醇体积分数进行考察，选择对高原毛茛中总黄酮提取影响较大的因素进行正交试验，并以得到的最优试验方案进行验证［8］。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 提取时间对高原毛茛总黄酮的影响 如图1所示，总黄酮吸光度随时间的延长先增大后降低。当提取时间延长至1.0 h后，总黄酮吸光度呈下降，即最佳时间为1.0 h。

图1 提取时间对高原毛茛总黄酮的影响

2.1.2 提取方法对高原毛茛总黄酮的影响 如图2所示，用超声提取法提取高原毛茛中的总黄酮时吸光度最大，其次是热回流法和煎煮法，冷浸法得到的总黄酮吸光度最低。

图2 提取方法对高原毛茛总黄酮的影响

2.1.3 料液比对高原毛茛总黄酮的影响 如图3所示，随着溶剂的增加，高原毛茛中总黄酮吸光度增大，当料液比达到1∶45时，高原毛茛中总黄酮吸光度最高。当溶剂进一步增大时，高原毛茛中总黄酮的吸光度又呈下降的趋势，即最佳料液比为1∶45。

图3 料液比对高原毛茛总黄酮的影响

2.1.4 乙醇体积分数对高原毛茛总黄酮的影响 如图4所示，高原毛茛总黄酮吸光度随着乙醇体积分数的增加，呈先上升后下降的趋势。当乙醇体积分数为70%时，总黄酮吸光度最高。

图4 乙醇体积分数对高原毛茛总黄酮的影响

2.2 正交试验

单因素试验考察发现，乙醇体积分数、提取时间、料液比对提取量影响较大，对总黄酮影响的大小顺序为乙醇体积分数＞提取时间＞料液比，因此选择提取时间、料液比、乙醇体积分数3个因素进行正交试验设计，每个因素均设置3个水平（表1）。由表2可知，高原毛茛中总黄酮提取的最佳条件组合为A3B1C3，即提取时间为1.0 h，70%乙醇溶液，料液比为1∶55，此时所得总黄酮含量为1.67 mg/g。

表1 正交因素与水平

表2 正交试验结果

2.3 验证试验

采用正交法得到的最佳条件，即70%乙醇溶液，料液比1∶55，超声条件下提取1.0 h，重复5次，所得到高原毛茛总黄酮平均含量为1.648 mg/g。

3 结论

通过单因素试验考察及正交试验结果可知，影响总黄酮含量的因素依次为乙醇体积分数、提取时间、料液比，最佳提取工艺条件为70%乙醇溶液提取1.0 h，料液比为1∶55。所得总黄酮含量较高，且提取方法较为简便、可操作性强、易于重现，可作为高原毛茛药材质量评价的依据。