一种犬瘟热病毒强弱毒株鉴别PCR检测方法的建立和初步应用

张 可，薛姣雄，喻 娇，唐青海※，曾繁荣，刘雪晴，隆泽桧，侯鑫军

(1.南岳山区生物资源保护与利用湖南省重点实验室，衡阳师范学院生命科学与环境学院，湖南衡阳421008；2.衡阳市畜牧水产事务中心，湖南衡阳421008)

犬瘟热病毒（Canine Distemper Virus，CDV）引起的犬瘟热（Canine Distemper，CD）传染性极高，临床症状的表现多样，各种年龄和性别的犬都会感染CDV，发病率高，染病的幼犬死亡率可达30%～80%[1,2]。CDV于1809年以来在世界范围内广泛流行，同年由Jeneer首次报道，1905年Carre发现其病原为一种病毒，1951年Dedie由组织培养方法分离得到CDV[3,4]。犬瘟热病毒的H基因是研究CDV变异情况的主要目的基因，H蛋白为CDV囊膜糖蛋白，具有血凝素功能，是病毒入侵宿主的重要调节蛋白，H基因变异会引起CDV的毒力变异，是最适合做CDV基因改变监测的基因[5,6]。

免疫接种是犬瘟热的预防控制主要手段，但曾经出现过免疫后的犬也感染了CDV的情况[7]，且很多临床检测和分离的CDV毒株与疫苗株具有很高的同源性及亲缘关系[8,9]，而弱毒疫苗是国内外使用最为广泛的犬瘟热疫苗，所以建立一种能鉴别CDV强弱毒株的检测方法至关重要。目前，能同时鉴别CDV强毒株和弱毒株的检测方法较少，研究最广泛的是聚合酶链反应（PCR）技术[10,11]，其高效灵敏，特异性强。除了PCR技术，目前已经被用来鉴别CDV强弱毒株的方法还有环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）[12]，在60℃～65℃的条件下进行15～60分钟左右的恒温扩增，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。

本试验主要根据CDV强毒株与弱毒株H基因的保守区域分别设计了2对特异性引物，通过优化PCR扩增反应的反应体系与反应程序来探寻最优的反应条件，从而建立一种犬瘟热病毒强弱毒株鉴别PCR的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株TOP-pMD19T-CDVH由南岳山区生物资源保护与利用湖南省重点实验室制备保存[13]；第一链cDNA合成试剂盒、HindⅢ、EcoRⅠ和ExTaq酶购自宝生物工程（北京）有限公司；质粒提取试剂盒购自Axygen公司。

1.2 标准阳性模板的制备

取5μL菌株TOP10-pMD19T-CDVH到已加有8μL氨苄青霉素的4 mL/管的LB液体培养基中，37℃、160 rpm摇床中振荡培养16～20 h。用Axyprep质粒DNA小剂量提取试剂盒提取TOP10-pMD19T-CDVH的重组质粒，质粒的酶切鉴定体系为：质粒DNA 7μL、EcoRⅠ和HindⅢ各0.25μL、10×Buffer 2μL、ddH2O 10.5μL，酶切条件：37℃、35 min，1.2%琼脂糖凝胶进行电泳检测析，并测定其浓度。

1.3 引物的设计与合成

根据GenBank中已登录的CDV基因序列，采用Primer Premier 5.0软件在CDV的H基因的保守区内设计4对特异性引物，引物信息见表1，其中，①与②为弱毒株的引物，③与④为强毒株的引物，由深圳华大基因科技有限公司合成。

1.4 PCR扩增引物的筛选

利用表1中4对引物进行第一次PCR扩增反应，反应体系为：质粒DNA 2.0μL（10 ng/μL）、Ex-Taq 12.5μL、上下游引物各1.0μL（10μmol/L）、灭菌去离子水ddH2O 8.5μL。反应的程序为：95℃5 min；98℃10 sec，62℃20 sec，72℃20 sec，30个循环；72℃10 min；4℃保存。将PCR扩增产物于1.2%的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。

表1 引物信息

1.5 PCR反应条件的优化

在第一次PCR扩增反应条件的基础上选择合适的引物、进一步探寻最优的PCR引物反应体系及反应程序，对反应总体系（10μL、15μL、20μL、25μL）、退火温度（72℃、68℃、62℃、56℃、50℃）、退火时间（5 s、10 s、15 s）、延伸时间（5 s、10 s、15 s）、循环次数（25、30、35、40、45）、阳性模板浓度（20 ng/μL、10 ng/μL、5 ng/μL、2.5 ng/μL）以及引物浓度（12.5μmol/L、10μmol/L、7.5μmol/L、6.25μmol/L、5μmol/L、2.5μmol/L）进行优化，确定最佳PCR反应条件。

1.6 犬瘟热病毒自然感染犬只的临床检测及病料采集

疑似犬瘟热感染犬只来自衡阳某养犬场，临床表现为有食欲减退、粪便呈水样、流眼泪、抽搐等症状。抽取5只犬的血液，编号为A1、A2、A3、B1和B2，另外再采集B1的粪便，用胶体金试纸条对5只犬的血液和B1的粪便进行检测。对犬进行解剖，观察犬的病理情况，取出病犬的心、肝、脾、肺、肾、肠等脏器备用。

1.7 PCR检测方法的初步应用

以A1、A2、A3、B1、B2的血液、心、肝、脾、肺、肾和肠为原料提取RNA，通过反转录合成第一链cDNA模板。其中，以A1、A2、B1、B2的血液以及A2的心、肝、脾、肺、肾、肠为原料制备的cDNA作为临床诊断的模板，用最优的反应体系及反应程序进行PCR扩增反应，反应体系为：cDNA 1μL，ExTaq 10μL，上下游引物（CDV-vac-F1397-1424与CDV-vac-R1587-1615，CDV-W-F1397-1424与 CDV-W-R1728-1752）各0.5μL，灭菌去离子水ddH2O 7μL。反应程序：95℃5 min；98℃10 sec，56℃5 sec，72℃15 sec，40个循环；4℃保存。PCR产物经1.8%琼脂糖凝胶电泳检测，拍照记录并分析结果。

2 结果

2.1 阳性模板的制备与鉴定

如图1所示，泳道2与泳道4为质粒，泳道1与泳道3为质粒的酶切产物，酶切结果为阳性，测得质粒的浓度为200 ng/μL，用无菌水稀释20倍（浓度为10 ng/μL）用于后续PCR扩增模板。

图1 菌株TOP 10-pMD19T-CDVH质粒及酶切检测结果

2.2 PCR扩增引物的筛选

采用引物（CDV-vac-F1397-1424和CDV-vac-R1587-1615）、（CDV-vac-F1101-1128和CDV-vac-R1423-1445）、（CDV-W-F1103-1128和CDV-W-R1423-1443）、（CDV-W-F1397-1424和CDV-W-R1728-1752）进行第一次PCR扩增，图2中泳道1和泳道2无特异性扩增条带，泳道3、泳道4在250 bp-500 bp之间都扩增出了明显的特异性条带，可知①②号引物不能扩增出特异性条带，③④能扩增出特异性条带，结果与预期大小相符，且④号引物比③号引物扩增效果更好。

图2 第一次PCR扩增

2.3 PCR反应条件的优化

如图3所示，四对引物的扩增结果与第一次PCR扩增时一致，20μL时扩增效果最好，但为降低试验成本，先选择10μL为后续所有优化试验的总体系，选择④号引物作为强毒株的最优引物，同时选择与④号引物条带相差更大的①号引物作为弱毒株的引物进行后续优化试验。图4所示，设定的退火温度条件下都有特异性条带，其中泳道6，即62℃时的扩增效果最好。如图5所示，泳道2、4、6都扩增出了特异性条带，确定最佳退火时间为5 s。如图6所示，泳道2和泳道4扩增出了特异性条带，但泳道4的条带不明显，最终选择泳道2的15 s为最佳延伸时间。如图7所示，PCR循环次数越多扩增效果越好，选择了扩增效果较好的40次为最佳循环次数。模板浓度的优化结果显示5 ng/μL为最佳模板浓度（图8）。引物浓度优化显示，PCR扩增效果相差不大，最终选择中间值6.25 μmol/L为后续扩增浓度（图9）。

图3 反应总体系优化

图4 退火温度优化

图5 退火时间优化

图6 延伸时间优化

图7 循环次数优化

图8 模板浓度优化

最终PCR反应的最佳反应体系为：模板体积1μL（浓度5 ng/μL），ExTaq酶10μL，上下游引物体积各0.5μL（浓度6.25μmol/L），ddH2O 7μL；最佳反应程序为：95℃5 min；98℃10 sec，56℃5 sec，72℃15 sec，40个循环；4℃保存。

（M2:DL1000 DNA Marker；1:引物浓度12.5μmol/L-引物④；2:引物浓度10μmol/L-引物④；3:引物浓度7.5μmol/L-引物④；4:引物浓度6.25μmol/L-引物④；5:引物浓度5μmol/L-引物④；6:引物浓度2.5μmol/L-引物④）图9引物浓度优化

2.4 犬瘟热病毒自然感染犬只的临床检测结果

胶体金试纸条检测结果表明，5只犬血液为CDV阳性，B1的粪便为CDV阴性（图10）。图11为5只犬的腹腔解剖图，从图中可看出这5只犬已经处于脱水状态，肠道空虚且肠粘膜充血，其他脏器眼观无明显病变。

图10 胶体金试纸条检测结果

图11 A1、A2、A3、B1和B2腹腔解剖

2.5 PCR检测方法的应用

用上述优化好的PCR扩增方法检测临床样本，结果显示，泳道1、泳道2、泳道3及泳道4所检测的为A1、A2、B1及B2的血液均为CDV核酸阳性，A2的心、脾和肾都在300 bp左右处出现了特异性条带，检测结果为阳性，且为强毒株所感染，但肝、肺和肠为CDV核酸阴性（图12）。

图12 临床诊断结果

3 讨论

本试验通过对CDV强弱毒株的H基因设计特异性引物，优化PCR反应体系及反应程序，建立了区分犬瘟热病毒强弱毒株PCR检测方法。所提取的强毒株模板不会与弱毒株扩增引物发生反应；强毒株的2对引物扩增的产物都出现了特异性条带，但引物CDV-W-R1423-1443和CDV-W-F1397-1424（引物③）所扩增的PCR产物都没有引物CDV-W-F1397-1424和CDV-W-R1728-1752（引物④）扩增的效果好。由于弱毒株的引物CDV-vac-F1101-1128和 CDV-vac-R1423-1445（引物②）与强毒株的引物④的条带大小相近，混合使用时PCR扩增结果不便区分，所以选用CDV-vac-F1397-1424和 CDV-vac-R1587-1615（引物①）作为弱毒株的引物。对反应总体系的优化中，虽然20μL的效果最好，从减少成本的角度，用10μL的总体系进行优化试验。退火温度、退火时间、循环次数、模板浓度及引物浓度的优化试验中，每种优化所设计的组别都能扩增出特异性条带，但产物的亮度会有一些差异；延伸10 s时，条带的亮度太浅，扩增效果不好，最后选择15 s延伸时间。

以本试验建立的CDV检测方法对CDV感染犬只样本进行检测，血液样本的PCR检测结果与胶体金结果完全相符；A2号犬只的肝、肺和肠PCR检测结果为CDV阴性，胶体金结果也显示肠道内容物为CDV阴性，由此可见，肝、肺、肠道及其内容不适宜作为CDV检测样本。PCR检测结果提示——心脏、脾脏、肾脏为CDV主要侵染器官。这些数据为CDV临床样本的准确采集提供了依据。

综上所述，本方法敏感性好、稳定性好、扩增效率高，可同时检测并区分犬瘟热病毒的强毒株和弱毒株，为犬瘟热病毒的有效诊断提供了技术支撑。