一株猪流行性腹泻病毒的分离鉴定及其致病性研究

黄文强，张志刚，郑 玲，辛雪梅，彭大新

(1.扬州大学兽医学院，江苏扬州 225000；2.上海东方希望集团上海畜牧有限公司，上海 200000)

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种高致死性、接触性传染病[1-3]，其发病特征以呕吐、腹泻、脱水、电解质紊乱为主，各种年龄阶段和不同品种的猪群都有易感性，且对哺乳仔猪、架子猪或育肥猪的危害更大[4]，尤其是哺乳仔猪受害最为严重，发病率高达100%，病死率为30%～80%[5]。

PEDV的形态是典型的冠状病毒形态[6]，形态学呈现多形性，近似于球形，病毒的外部有囊膜，囊膜上有纤突，纤突之间的间距较大，并且排列比较规范，呈花瓣样放射状，纤突的长度约为20 nm左右，PEDV粒子的大小为95 nm～190 nm，平均直径为130 nm。核酸为线性单股正链RNA[7]，其表面具有3种结构蛋白，即纤突蛋白(S)、膜蛋白(M)和包膜蛋白(E)[8]。其中M蛋白位于PEDV的囊膜表面，是囊膜上含量最多的蛋白，在不同的PEDV毒株之间具有相对保守性，常常使用其作为建立PEDV的RT-PCR方法和流行病学的研究工具的靶基因[9]。

该病从2010年开始严重暴发流行，原有疫苗保护效果较差，提示可能存在变异株[10-13]。近年来PED流行范围不断扩大，呈现地方流行性，是严重威胁我国和全球生猪养殖的重要疫病。为了进一步研究该病原的致病性特征，加强对PED的防控，本研究从江苏省某猪场发生疫情的5日龄仔猪粪便和肠道中分离1株PEDV，以期为PEDV的致病机理研究和疫苗研制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料与细胞 无菌采集江苏某猪场5日龄腹泻仔猪的小肠及内容物，置-80℃冰箱保存备用。Vero细胞为中国兽医药品监察所保存。

1.1.2 主要试剂 RNA提取试剂盒、DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒、PremixTaqTMTaKaRaTaqTMVersion 2.0)、PrimeScriptTaqTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit、DL 2 000 DNA Marker，宝生物工程(大连)有限公司产品；MEM培养基、胎牛血清、双抗(青霉素、链霉素)，Hyclone公司产品；胰酶，Gibco公司产品。

1.1.3 引物设计 根据GenBank中AF353511.1序列设计扩增PEDV M基因的引物，PEDV-F/R分别为5′-AACGGTTCTATTCCCGTTGATG-3′和5′-TAAATGAAGCACTTTCTCACTATA-3′,预期扩增长度为663 bp。猪瘟病毒(CSFV)[14]、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)[15]、猪传染性胃肠炎病毒(TEGV)、猪轮状病毒(PRV)[16]引物序列参考已发表论文中的引物序列；所有引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

1.1.4 主要仪器 生物安全柜，MVE公司产品；酶联免疫检测仪，Bioteck公司产品；CO2培养箱，NVAIRE公司产品；倒置荧光显微镜，Olympus公司产品；-80℃超低温冰箱、PCR仪，美国Thermo Fisher公司产品；凝胶成像仪，美国Bio-Rad公司产品。

1.2 方法

1.2.1 病料处理 将病料加入5倍体积含双抗(青霉素100 IU/mL，链霉素100 μg/mL，pH7.2)的PBS溶液(pH7.2)研磨，反复冻融3次，8 000 r/min离心10 min，无菌吸取上清液，用0.22 μm滤器过滤后置-80℃冰箱保存备用。

1.2.2 RT-PCR检测 取1.2.1处理过的病料上清，根据TaKaRa公司RNA/DNA提取试剂盒说明书，进行病毒RNA/DNA的提取，将提取出来的RNA用反转录试剂盒反转录为cDNA。对提取出的cDNA和DNA进行猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒的PCR鉴定，检测体系和条件按常规检测方法操作。

1.2.3 病毒分离 复苏Vero细胞，将长成单层致密的Vero细胞弃去培养液，用MEM洗3遍后按10%的接毒量加入处理好且PEDV检测结果为阳性，其他病毒检测结果为阴性的病料上清，37℃吸附1 h后，加入终浓度为10 μg/mL胰酶的维持液[10]，置于培养箱中培养72 h后盲传，同时设不加病料上清的终浓度为10 μg/mL胰酶维持液的Vero细胞作为健康对照。当观察到细胞病变后，采集培养液上清，连续传代2次。

1.2.4 病毒含量的测定 用MEM培养基将毒种做10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-7、10-84个稀释度，分别接种已长成良好单层的Vero细胞96孔细胞培养板，每个稀释度接种6孔，100 μL/孔，置37℃作用1 h，弃液，加入MEM培养基，100 μL/孔，同时设正常细胞对照，置37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养7 d，每日观察并记录细胞病变(CPE)，按Reed-Muench法计算TCID50，距离比例=(高于50%病变率的百分数-50%)/(高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数)。

1.2.5 M基因序列分析 取1 μL的TaKaRa随机引物、1 μL dNTP Mixture (10 mmol/L each)，加入8 μL总RNA中，置于65℃金属浴5 min后，冰上迅速冷却。于上述变性后反应液中加入5×buffer 4 μL，Prime Script Ⅱ RTase (200 U/μL)反转录酶1 μL，RNA酶抑制剂0.5 μL，RNase Freed dH2O 4.5 μL总体积20 μL。反应条件：42℃反转录1 h，95℃ 5 min后，冰上冷却。

取上述2 μL cDNA作为模板进行RT-PCR，反应按如下体系在PCR管中进行，2×PremixTaq25 μL，引物PEDV-F、PEDV- R各1 μL，灭菌水21 μL，总体积50 μL。反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，共30个循环；最后 72℃延伸10 min。

将电泳结果为阳性的PCR产物，按照TaKaRa公司的胶回收试剂盒说明书进行PCR产物纯化，纯化后由苏州金唯智生物科技有限公司测序。利用DNA Star软件进行分析，使用Mega 7软件对NJ方法对核苷酸序列进行遗传进行分析。

1.2.6 动物回归试验 将10头7日龄仔猪随机分为感染组(n=5)和对照组(n=5)。感染组每头仔猪口服2 mL含量为106.0TCID50/mL的病毒；对照组每头仔猪口服相同体积的PBS。接种后每日观察仔猪临床表现并记录，对出现严重腹泻或垂死的仔猪给予安乐死。

1.2.7 半数致死量试验 将18头7日龄仔猪随机分为4组，第1、2、3组为试验组，每组5头猪；试验组分别口服接种2 mL，病毒含量依次为104.5、105.5、106.5TCID50/mL的F6代分离株。第4组为对照组，3头猪，每头仔猪口服相同体积的细胞培养液。接种后每日观察仔猪临床表现并记录，连续观察10 d。试验结束时，统计各组仔猪的死亡率，按照Reed-Muench法计算其半数致死量(LD50)。

2 结果

2.1 腹泻病原RT-PCR检测

将提取的DNA及RNA进行7种病毒(PCV2、CSFV、PRRSV、PPV、TEGV、PEDV、RV)的PCR检测，其中1份DNA/RNA样品成功扩增出长度约为663 bp的目的片段(图1)。将PCR产物进行纯化后，送至苏州金唯智生物科技有限公司测序，测序结果表明，与GenBank上PEDV M基因同源性高达99%以上。

2.2 病毒分离

PEDV阳性病料接种Vero细胞后，盲传到F4代，出现明显病变，主要表现为细胞表面粗糙，颗粒增多，有多核细胞，并可见空斑样小区，细胞脱落等病变特征(图2A)。而对照细胞保持致密的单层，呈长梭形，轮廓清晰，细胞脱落极少(图2B)。将分离株命名为PEDV JS14株。将PEDV JS14株连续传代至F6代，细胞病变比较稳定，对分离得到的F4代～F6代PEDV JS14株的病毒含量进行测定，并使用Reed-Muench方法进行计算，结果表明，F4代病毒含量为105.5TCID50/mL，F5代病毒含量为106.0TCID50/mL，F6代病毒含量为106.5TCID50/mL。

M.DNA 标准DL 2 000;1、3、5、7、9、11、13.分别PPV、CSFV、PRRSV、RV、TEGV、PCV2和PEDV的阳性对照；2、4、6、8、10、12、14.分别是以病料为DNA/cDNA进行PPV、CSFV、PRRSV、RV、TEGV、PCV2和PEDV的核酸扩增结果

A.接毒后的细胞;B.正常Vero细胞A.Vero cells after inoculation;B.Normal Vero cells

2.3 分离毒株M基因序列分析

对F0代～F8代细胞培养物提取核酸进行RT-PCR扩增，产物大小与预期一致(图3)。回收PCR产物，送往苏州金唯智生物科技有限公司测序。将获得的JS14株M基因序列与国内外具有代表性的19株PEDV毒株进行同源性比对分析，发现其与KF272920.1同源性最高，达到99.9%(图4)。M基因遗传进化分析表明，JS14株与美国分离毒株KF272920.1属于同一分支，具有较近的亲缘关系，而与经典毒株CV777存在一定进化距离(图5)。

图4 PEDV M基因序列同源性比对

图5 PEDV M基因遗传进化分析

2.4 动物回归试验

试验组5头7日龄仔猪口服接种JS14株F6代10 h后，均出现厌食、呕吐、腹泻等症状；30 h后症状加重，4头仔猪死亡；42 h后剩余1头仔猪出现水样粪便、内有凝乳样白色和淡黄色块状物，被毛粗糙，仔猪消瘦明显等症状。试验期间，对照组仔猪未出现上述临床症状。剖检病死猪发现，小肠扩张，部分肠壁变薄呈透明状有出血点，肠系膜充血显示(图6A～图6D)。试验结果表明，JS14分离株接种仔猪后，可引起PED典型的临床症状，结合RT-PCR、细胞病变观察结果，最终确定该分离毒株为PEDV强毒株。

M.DNA 标准DL 2 000;1.阴性对照；2.阳性对照；3～11.分别为F0～F8的细胞培养物的核酸；12～17.分别为F8代细胞培养物的PPV、CSFV、PRRSV、RV、TEGV、PCV2鉴定

A.淡黄色呕吐物；B.淡黄色水样粪便；C.小肠部分肠壁变薄呈透明状有出血点；D.肠系膜充血

2.5 半数致死量

将PEDV JS41株F6代病毒液口服接种7日龄人工哺乳仔猪，观察期内，不同病毒滴度(106.5、105.5、104.5TCID50/mL)的试验组均出现典型临床症状，主要表现为呕吐、腹泻、水样粪便等症状。接种滴度为106.5TCID50/mL的5头仔猪全部死亡，发病率为100%，病死率为100%。接种滴度为105.5TCID50/mL的5头仔猪中，有4头死亡，发病率为100%，病死率为80%。接种滴度为104.5TCID50/mL的5头仔猪中，有1头死亡，发病率为60%，病死率为20%(表1)。Reed-Muench法计算结果表明，其半数致死量为105.0TCID50/mL。

表1 JS14株感染7日龄仔猪发病率及死亡率

3 讨论

本试验通过对发病猪场10日龄内腹泻仔猪的粪便和病死猪小肠内容物进行PEDV病原的RT-PCR检测，同时对该阳性病料进行了外源病毒检测(PCV2、PRRSV、CSFV、TEGV、RV、PPV)筛选出一份PEDV结果呈阳性，其他病毒检测结果为阴性的样品。将该阳性病料接种Vero细胞，进行PEDV的初步分离工作。PEDV分离方面，我国报道较早的是李树根等[17]采用添加胰酶的细胞维持液成功地将分离的PEDV适应于Vero，并筛选出了最佳的胰酶用量。本试验通过在维持液中加入10 μg/mL胰酶，成功的分离到了可在Vero细胞系上产生稳定细胞病变的PEDV JS14株，该毒株在盲传第4代时出现病变，提示病毒已经适应了Vero细胞，将PEDV JS14株连续传代至F6代，细胞病变比较稳定，其病毒含量达到106.5TCID50/mL。与之前分离的毒株相比，其病毒滴度高于早年间发现的毒株，例如：PEDV-HZ(病毒滴度为105.7TCID50/mL)、PEDV SD201604株(病毒滴度为103.5TCID50/mL)[18-19]。

本试验对PEDV JS14株致病性进行了初步研究，在攻毒10 h后，5头仔猪均出现厌食、呕吐、腹泻等症状；攻毒30 h后，3头仔猪死亡；攻毒42 h后，剩余2头仔猪出现水样粪便、内有凝乳样白色和淡黄色块状物，被毛粗糙，仔猪消瘦明显等症状，而对照组仔猪未出现上述临床症状。与PEDV TX株相比[20]，试验动物出现典型症状时间早，病程长，发病症状严重，说明本研究分离的毒株，病毒含量高，致病性强。M基因的遗传进化树显示与美国分离株KF272920.1同源性最高，可能与种猪引进的来源有关，需对其他基因进行序列分析来进一步验证。

综上所述，本研究成功分离到1株猪流行性腹泻病毒，将其命名为PEDV JS14株，并将JS14毒株在Vero细胞上连续传代培养。通过细胞病变、RT-PCR检测进行鉴定，动物回归试验证实为PEDV强毒株，为PEDV的生物学特性的进一步研究提供了参考。