马来亚豪猪中国亚种皮肤伤口无疤痕愈合能力的研究

李彦翯，尹 俊

（内蒙古农业大学生命科学学院，内蒙古 呼和浩特 010018）

豪猪（Hystrix）又称箭猪，以背部长有棘刺而闻名，具有较高的观赏价值、经济价值和科学研究价值。 豪猪在分类学上属于脊椎动物门哺乳纲真兽亚纲啮齿目豪猪科，在豪猪科内，又可以细致划分为3 个属，分别为帚尾豪猪属、豪猪属和长尾 豪 猪 属［1-4］。

在3 个属的豪猪中，豪猪属（Hystrix）的体型较为肥大，最大者体长在70 cm 以上［5-6］。豪猪属为啮齿目豪猪科的1 属，通称豪猪，共8 种，分别是开普敦豪猪（Hystrix africaeaustralis）、非洲冕豪猪（Hystrix cristata）、马来亚豪猪（Hystrix brachyura）、粗棘印尼豪猪（Hystrix crassispinis）、冠豪猪（Hystrix indicus）、爪哇豪猪（Hystrix javanica）、巴拉望豪猪 （Hystrix pumila）、 苏门答腊豪猪（Hystrix sumatrae）， 中国仅1 种， 即马来亚豪猪中国亚种（Hystrix brachyura hodgsoni）。

马来亚豪猪中国亚种（以下简称马来亚豪猪）广泛分布于我国的中原和南方地区的森林和田野地带，一般昼伏夜出，以植物为食，是一种珍稀的陆生野生动物，因为具有很高的食用、药用和观赏价值，深受消费者喜爱。马来亚豪猪整个头部与老鼠的头部外形相似，颧弓不外扩，但鼻腔膨大，具有头小、眼小、四肢短粗的外形特征，口内有20 枚齿根很浅的牙齿［7-10］。 马来亚豪猪体表皮肤很脆弱，背部与尾部生有长而硬的棘刺，这些棘刺可以起到防御天敌的作用，遇到硬物极易脱落。

大多数动物具有一定的器官修复和组织再生的能力。皮肤是脊椎动物中面积最大的器官，拥有极强的自我修复能力， 可以通过不断进行的新陈代谢完成修复和再生， 起到维持机体正常生命活动的作用，是机体抵御外在伤害的屏障［11-13］。 皮肤组织的修复分为两种方式：第一种叫完全再生，也即组织的结构和功能完全恢复到损伤前的状态；第二种叫不完全再生， 也即伤口处不能恢复原有结构和功能（损失的功能包括皮肤张力下降或缺失等），由纤维组织增生代替缺损组织［14］。皮肤的不完全再生过程，会导致疤痕的形成。

疤痕的产生主要是因为在皮肤组织修复过程中，伤口感染的部位胶原蛋白丢失过多，导致伤口变得脆弱的同时， 皮肤和筋膜不会再获得充分的张力， 这些原因导致在伤口重新塑形期间极容易产生疤痕。疤痕形成后，即使愈合伤口处的张力已恢复正常，但仍缺少弹性，而伤口软组织弹性的消失，还可能导致皮肤明显的功能障碍［15］。在豪猪的养殖过程中， 经常出现因打斗发生皮肤撕裂的情况，但在皮肤撕裂后，伤口能快速以无疤痕方式收缩愈合，皮肤组织张力得到明显恢复，显示出极特殊的伤口愈合能力，极具研究价值。

为了探索豪猪伤口愈合的过程与皮肤无疤痕修复机制，以马来亚豪猪的耳朵为研究对象，制造了贯穿伤与撕裂伤两种伤口， 对二者的愈合过程进行了形态学观察。 以期通过研究豪猪无疤痕伤口愈合方式，了解皮肤无疤痕修复的机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物 马来亚豪猪中国亚种： 河南省新密市某豪猪养殖场，雄性豪猪3 只。

1.1.2 试剂 注射用盐酸替来他明盐酸唑拉西泮（Virbac S.A.）， 多聚甲醛（sigma，P6148），石蜡（Leica），二甲苯（天津市登科化学试剂有限公司），无水乙醇（天津市登科化学试剂有限公司），组织防脱载玻片（海门市神鹰实验器材厂），盖玻片（天津市登科化学试剂有限公司）， 伊红（sigma，HT110116-500 mL），苏木素（sigma，GHS116-500 mL），盐酸（天津市化学试剂三厂），碳酸锂（天津市化学试剂三厂），中性树胶（国药集团化学试剂有限公司）等。

1.1.3 试验仪器及耗材 剪刀，手术刀，止血钳，取样管，记号笔，相机，冰箱，摇床，恒温箱等。

1.2 试验方法

1.2.1 豪猪耳朵贯穿伤口 在豪猪的一只耳朵上制造直径1 cm 的穿孔（见图1），以7 d 为节点进行拍照和记录其伤口愈合状况。

图1 豪猪耳朵贯穿伤口

1.2.2 豪猪耳朵撕裂伤口 对豪猪另一只耳朵制造0.5 cm×1 cm 的撕裂伤口（见图2），以7 d 为节点分别为豪猪耳朵伤口拍照， 用尺子对伤口直径进行垂直和横向测量，用于计算伤口表面积。创面愈合率计算公式：创面愈合率＝（原始创面面积－当前创面面积）/原始创面面积×100%。

图2 豪猪耳朵撕裂伤口

1.3 伤口愈合组织切片

1.3.1 愈合组织取材 豪猪做撕裂处理的耳朵伤口愈合部位的部分区域选取大小为0.5 cm×1 cm的皮肤组织（要求此区域的皮肤完好无疤痕），用碘伏和酒精棉依次擦拭所选部位， 并对采集工具如手术刀、剪子、止血钳、镊子等用酒精棉擦拭消毒。将豪猪麻醉，用手术刀片割取所选部位的皮肤组织，将所取的皮肤组织放入事先配好的4%多聚甲醛溶液，4 ℃过夜处理。

1.3.2 豪猪皮肤样本的处理 次日将经多聚甲醛溶液过夜处理好的皮肤组织样品取出， 用70%、80%、95%、100%酒精对皮肤进行梯度脱水， 每次需用摇床振荡1 h，次日更换1 次无水乙醇，-20 ℃保存。

1.3.3 豪猪皮肤样品石蜡组织切片的制作［16］

①修整组织块： 取已经处理好的皮肤组织样品，用事先消毒的手术刀和镊子修整皮肤组织，使皮肤组织上毛的方向与皮肤纹理的方向一致。

②透明： 将修整好的皮肤组织样品放入二甲苯，使皮肤组织透明，透明过程中随时观察组织颜色变化，判断组织透明程度。若首次二甲苯透明不完全，可以更换几次二甲苯提高透明的效率，直到组织可以透过光线。

③浸蜡：取透明好的皮肤组织样品，放入50%石蜡（熔点为58 ℃）和50%二甲苯的混合溶液过渡1.5 h；再用石蜡（熔点为58 ℃）浸浴组织1.5 h，然后换用熔点为60 ℃的石蜡对皮肤组织浸蜡1.5 h，以上步骤都在60 ℃的恒温箱中进行。

④修块：待浸蜡完成后，将组织和石蜡一起倒入事先准备好的模具，快速用准备好的镊子调整好皮肤组织的毛囊方向后进行包埋， 放入4 ℃冰箱中静置一夜，待次日石蜡完全凝固后，将包埋好的蜡块从模具中取下， 切除边缘多余的石蜡进行修整，制成含有皮肤组织的石蜡块，并在石蜡底座处做好标记，以便后期制作切片用。

⑤切片： 将包埋好的皮肤组织石蜡块用切片机切成7～9 μm 薄厚的石蜡切片，在载玻片上记录好时间后保存于切片盒中，以便后期镜下观察。

1.3.4 豪猪皮肤样品石蜡组织切片的HE 染色

1.3.4.1 试剂配制 将伊红用蒸馏水稀释2～3倍，配制成伊红溶液备用。 以70%的酒精为溶剂，将浓盐酸配制成终浓度为0.5%的盐酸溶液作为分化液。

1.3.4.2 烘片 将石蜡切片放入烘片机 （60 ℃），待石蜡融化后取出，使温度降至室温。

1.3.4.3 石蜡切片的染色

（a）石蜡切片的脱蜡水化：①二甲苯（Ⅰ）脱蜡5 min→②二甲苯 （Ⅱ） 脱蜡5 min→③无水乙醇（Ⅰ）5 min→④无水乙醇（Ⅱ）5 min→⑤95%乙醇3 min→⑥80%乙醇3 min→⑦70%乙醇3 min→⑧蒸馏水3 min。

（b）苏木素染色：将切片用苏木素染液染色11 min，之后用自来水冲洗1 min。

（c）分化：分化液分化2 s，自来水冲洗20 s，洗掉分化液即可。

（d）返蓝液返蓝：用饱和碳酸锂返蓝30 s，自来水冲洗20 s，洗掉返蓝液即可。

（e）伊红染色：伊红染色8 s，自来水冲洗3 s。

（f）脱水、透明、封片：①80%乙醇3 min→②90%乙醇3 min→③95%乙醇（Ⅰ）3 min→④95%乙醇（Ⅱ）3 min→⑤无水乙醇（Ⅰ）3 min→⑥无水乙醇 （Ⅱ）3 min→⑦二甲苯 （Ⅰ）3 min→⑧二甲苯（Ⅱ）3 min→⑨中性树胶固封，镜下观察。

2 结果与分析

2.1 豪猪伤口愈合过程观察分析

贯穿伤的伤口如图3 所示，创缘分离，不能严密对合，属于开放性创口，创面较大，常伴有感染。由于豪猪个体间差异， 其伤口再生速度会略有不同，对0～63 d 的几个时间点的伤口愈合情况进行了观察分析。 在伤口形成的第1 天，3 只豪猪的耳朵伤患处出现红肿，炎症反应明显；第7 天上皮化明显，坏死组织被清除以后，组织再生开始；第14天，因伤口较大，伤口收缩明显，坏死组织脱落基本完成；在第21 天，大量的肉芽组织从伤口的底部或边缘生长出来，填充伤口，愈合伤口边缘；第35～63 天伤口处没有明显的开口表面积的关闭。由此可以说明经过穿孔的耳朵， 因被破坏了软骨结构，耳部伤口不能完成再生，所以耳朵愈合过程迅速停止。

图3 豪猪耳朵贯穿伤口愈合过程图

撕裂伤的伤口（见图4），在第0 天和第63 天之间的常规时间点进行了撕裂伤的观察。 3 只豪猪的耳朵伤患处在第1 天伤口少量出血并产生血凝块，局部血管反应的特征为初期血管收缩，炎症反应轻微。 在24～48 h 内伤口表面或边缘可以相对较快地止血，但不能有效地进行愈合，创面表现为充血、浆液渗出及白细胞游出，局部红肿；在第7 天，表皮开始生长，表面由渗出液中的纤维蛋白原、 血液及坏死脱落的物质经过干燥形成一层黑褐色表皮； 第14 天可见伤口处组织开始变白，新生血管、肉芽组织和结缔组织形成，新的毛细血管清晰可见。 21 d 后覆盖伤口表面的表皮结构已基本正常， 纤维组织仍富含细胞， 胶原组织不断增加，抗拉力强度增加，耳朵新生组织处的张力慢慢恢复，富有弹性；28 d 后，边缘的整层皮肤及皮下组织向中心移动，于是伤口迅速缩小，第35 天至第56 天伤口处白色结缔组织面积缩小， 可以观察到新生长出来的皮肤组织的颜色由浅变深， 第63天伤口完全愈合并且无疤痕产生。

图4 豪猪耳朵撕裂伤口愈合过程图

在受伤63 d 后，3 只豪猪耳朵撕裂伤都完成了伤口愈合。从两种伤口恢复过程可以看出，贯穿伤因破坏了豪猪的软骨构架，不能进行完全愈合。撕裂伤面积较大， 但由于豪猪有着极强的伤口愈合能力（见图5），可以在63 d 内以无疤痕的方式进行了表皮和毛囊完全再生。

图5 豪猪耳朵伤口愈合速率

2.2 豪猪耳朵创面组织学分析

对豪猪完全愈合的撕裂伤创面进行取样，做石蜡切片和HE 染色进行组织学分析。

将豪猪耳朵愈合组织进行石蜡切片和HE 染色处理，用显微镜拍照，两个豪猪创伤愈合后的组织学图片整理结果如图6 所示：豪猪伤口愈合后，愈合后的伤口组织即为正常的组织， 可观察到表皮层和真皮层，层次分明，排列有序。

组织学检查表明， 完好的未经处理的豪猪耳朵组织，毛囊（如图6A1、A2黑色箭头所示）、脂肪组织（如图6A1、A2白色箭头所示）、皮脂腺（如图6A1、A2红色箭头所示）、毛细血管清晰可见，表皮完整（见图6A1、A2）。 伤口愈合后的新组织未见疤痕组织（见图6B1、B2），由正常的细胞组成，即脂肪组织（图6B1、B2白色箭头所示）、毛囊（图6B1、B2黑色箭头所示）、 皮脂腺 （图6B1、B2红色箭头所示）、真皮和表皮等。 愈合后的耳朵组织结构与正常未受伤的耳朵结构相似。由此可知，豪猪耳朵无疤痕伤口愈合后能够维持正常的生理功能及活动，实现了完全再生。

图6 豪猪耳朵皮肤组织在不同时间点的病理学变化

3 讨论

皮肤再生与修复，又称伤口愈合，是指皮肤受到外力作用导致破损或缺损后的愈合， 损伤组织修复使得组织细胞再生。伤口愈合期间因伤口大，组织缺损多，创口边缘分离较远，所以易受感染。只有控制感染，清除坏死组织方能开始再生。许多动物因伤口处受伤严重，愈合时间较长，导致在伤口愈合前遗留明显疤痕。 耳朵是一个结构简单的器官，耳朵中央由薄的弹性软骨组成，外层有脂肪组织和肌肉层，最外层是真皮和表皮，蕴含丰富的毛囊和皮脂腺，含有较少的表皮附属物。选择耳朵作为研究对象更加方便进行组织学观察。

接受外科手术或有严重创伤（特别是烧伤）的患者会出现疤痕，导致永久性功能丧失和毛囊等附属物的缺失［17］，这属于不完全再生。相比之下，完全再生意味着在损伤后几乎完全重现原始组织结构。 1953 年研究者首次描述了兔子耳孔的无疤痕闭合［18-19］和非洲刺鼠的皮肤伤口再生［20-21］过程，研究发现这两个物种的皮肤均显示出一定的撕裂性，导致的大面积伤口能够在2 个月内完全闭合，组织学检查显示再生区含有真皮、表皮、软骨、毛囊和脂肪组织，由于同不完全再生相比，它们能够通过修复使皮肤具有完整的原始组织结构， 故被称为完全再生。

尽管非洲刺鼠皮肤伤口再生的试验取得了一些进展， 但哺乳动物毛囊的再生还远未被充分了解， 部分限制因素是哺乳动物的毛囊再生实例仍然很少。豪猪、刺鼠和兔子等物种由于皮肤脆弱而具有撕裂倾向，导致面积较大的伤口，在伤口处的表皮和毛囊可在一定时间内进行再生［22-23］，而豪猪的这种再生表型在其耳朵伤口愈合中充分体现了无疤痕再生的过程。

通过对豪猪耳朵贯穿伤口和撕裂伤口的比较， 分别对其耳朵制造0.5 cm×1 cm 的撕裂伤和1 cm×1 cm 的贯穿伤口，结果显示贯穿伤的软骨组织无法完全再生， 贯穿伤口的耳朵只是愈合了伤口的边界，没有明显的伤口闭合，不能再生软骨结构，而撕裂伤口能够在63 d 内以无疤痕的方式完全愈合，这一过程再现了豪猪伤口再生的进程，豪猪耳朵撕裂伤能够以无疤痕的方式进行表皮、皮脂腺、毛囊等修复的伤口愈合，提供了一个理想的模型系统，以便检查哺乳动物的表观形态再生。