天然抗氧化剂对红烧肉烹饪过程中热加工 危害物形成的控制

刘李春，蒋玉洁，申明月，谢明勇，聂少平*

（南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047）

食品热处理过程中可能会发生脂质氧化、蛋白质降解和美拉德反应等复杂的化学反应，与此同时伴随着有害物质的形成，如丙烯酰胺（acrylamide，AM）[1]、 反式脂肪酸（transfatty acid，TFAs）[2]和呋喃（C4H4O）[3]等。AM存在于各种热加工食品中，其具有神经毒性和遗传毒性，并且已经被国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer，IARC）列为2A类致癌物质[4]。AM的形成途径很多，天冬酰胺和丙烯酸为AM的重要前体物质。其中在富含碳水化合物的体系中天冬酰胺和还原糖之间的美拉德反应是形成AM的主要途径[1]，而在肉制品中油脂经过高温分解为甘油和脂肪酸，进而脱水氧化形成丙烯酸，最后产生AM，同时肉制品中的肌肽经过水解脱氨后会产生丙烯酸，进而生成AM[5]，丝氨酸和半胱氨酸的热降解也能形成丙烯酸，然后产生AM[6]。膳食中TFAs主要来源于油脂氢化、精炼、反复煎炸和反刍动物的脂肪组织及乳制品[7]。TFAs的摄入会增加体内低密度脂蛋白水平，降低高密度脂蛋白水平，从而加大患心血管疾病的风险[8]。也有研究表明4～5 岁儿童摄入的TFA含量与肥胖呈正相关[9]。呋喃是一种杂环芳香族化合物，广泛存在于罐装蔬菜、水果和肉类、咖啡、婴儿配方奶粉、酱油等食品中[10-11]。1995年，IARC将呋喃列为 2B组类物质（可能对人类致癌）[12]，引起了人们对呋喃引发的健康风险的关注。呋喃的前体物质是食品中常见的营养物质，其形成的主要途径是抗坏血酸和糖的降解、多不饱和脂肪酸和类胡萝卜素的氧化或糖和氨基酸之间的美拉德反应[13]。

随着人们对食品安全的日益关注，天然的食品抗氧化剂已成为研究热点。天然植物抗氧化剂是指为防止或者延缓食品氧化、提高食品的稳定性和延长贮存期而加入到食品中的天然物质[14]。其中竹叶抗氧化剂（antioxidant of bamboo leaves，AOB）、茶多酚和迷迭香提取物等天然抗氧化物质已被列入国家相关标准，可作为食品添加剂应用于肉制品、油炸食品、焙烤食品等[15]。AOB是从竹叶中提取到的一种淡棕色抗氧化成分，其包含绿原酸、咖啡酸、荭草素和异荭草素等活性物质，可以阻断脂质自氧化的链反应，螯合瞬态金属离子，清除腈化物并阻断亚硝胺的合成[16]。有研究表明在炸鸡翅中分别添加0.10%（以鸡翅质量计，下同）和0.50%的AOB时，对AM的抑制率分别可达57.8%和59.0%，并且当AOB的添加量小于0.50%时，可保留油炸鸡翅原始的风味[17]。酱鸭中添加0.20%的AOB时具有良好的抗氧化性，可以有效抑制过氧化值和酸价上升[18]。茶多酚是茶叶中所含的一类多羟基酚类化合物，主要包括表没食子儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯和表儿茶素，具有高抗氧化、强抗菌作用以及抗癌作用[19]。 高浩祥等研究了茶多酚在油炸过程中对马铃薯片的品质及AM的抑制情况，发现茶多酚不仅可以提高马铃薯片的品质，同时可以有效抑制AM的生成[20]。Bi等在罐装咖啡模型中添加12.1%茶多酚，发现其对呋喃的抑制率可达42.4%[21]。迷迭香酸是一种天然的水溶性多酚类化合物，在紫苏油和迷迭香中含量很高，具有抗氧化、抗菌和抗肿瘤等作用，一直以来被广泛应用于食品和化妆品行业[22]。 王苗苗等研究了不同抗氧化剂对大鲵油的抗氧化作用，发现添加0.020%的AOB、迷迭香酸和茶多酚时，其抗氧化效果由高到低为AOB＞迷迭香酸＞茶多酚[23]。

中式菜肴作为一种典型的热加工食品，其热加工危害物受到的关注较少。红烧肉作为中式菜肴的典型代表，因其肥而不腻、瘦而不柴的特点备受国人的喜爱。五花肉为制作红烧肉的主要原料，其富含蛋白和脂肪，含有丰富的AM和呋喃的前体物质。红烧肉在制作的过程中还会使用植物油，有形成TFAs的风险。本课题组前期研究发现红烧肉在烹饪过程中加入糖、酱油等调味料后，AM的平均含量达到42.4 μg/kg[24]。目前，大量文献报道了AOB、茶多酚和迷迭香酸等天然抗氧化剂对焙烤、油炸食品中热加工危害物的抑制作用，但是天然抗氧化剂对中式菜肴中热加工危害物形成的影响目前鲜见报道。本实验以红烧肉为研究对象，通过分别添加不同质量浓度的AOB、茶多酚和迷迭香酸来考察其对热加工危害物AM、TFAs及呋喃形成的影响，分别建立抗氧化剂质量浓度与危害物生成量的关系曲线图，定量描述了这3 种天然抗氧化剂对红烧肉中热加工危害物形成的影响，以期为中式菜肴热加工危害物的控制阻断技术提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

精选五花肉、料酒、酱油、食盐、白糖、八角、大豆油皆购于江西省南昌市天虹超市。

水溶性竹叶抗氧化剂AOB-I（总黄酮质量分数＞20%） 杭州尤美特生物科技有限公司；天然水溶性茶多酚（纯度＞98%） 上海国药集团；迷迭香酸（纯度＞96%）、呋喃（纯度＞99%）、D4-呋喃（纯度＞99%）、甲酸（纯度＞98%）和顺反异构亚油酸、亚麻酸甲酯混合标准品 美国Sigma-Aldrich公司；AM （纯度≥99.8%） 上海Aladdin试剂公司；13C3-AM标准品（纯度≥99.99%） 美国剑桥同位素实验室；二十一烷酸甘油三酯（C21:0）、GLC-463脂肪酸甲酯混合标准品 美国NU-CHEK公司；其他化学试剂均为分析纯且购于上海Aladdin试剂公司。

1.2 仪器与设备

1290/6460A液相色谱-三重四极杆串联质谱仪、7890A/5975C气相色谱-质谱联用仪（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）、G7367-64100 CTC自动进样器、6890气相色谱仪 美国安捷伦公司；Milli-Q Gradient超纯水器 美国Millipore公司；ΧP201电子 天平 瑞士Mettler Toledo公司；Anke TGL-16G-A型离心机 上海安亭科学仪器厂；ND2002-2氮吹仪 杭州瑞诚仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 红烧肉的制备

初加工：将五花肉洗净，切成块状（3 cm×3 cm×3 cm），分别刷上不同质量浓度（0（空白）、0.1、0.15、0.2、0.5 g/L）的AOB、茶多酚和迷迭香酸溶液；爆炒：将电磁炉调到900 W，加入15 mL的大豆油，然后将刷完抗氧化剂的块状五花肉块于锅中进行30 s爆炒；炖煮：取爆炒后的肉块（每组4 块），加入15 mL的料酒、酱油2.5 mL、八角3 g和不同质量浓度的天然抗氧化剂溶液400 mL，大火（1 200 W）烧开，撇去浮层杂质，然后改小火（600 W）慢炖45 min；收汁：加入食盐2 g、白糖5 g，开盖大火（1 200 W）红烧，至汤汁黏稠，制作完成。

取加工完成的红烧肉适量，粉碎机绞碎，冷冻干燥，再次粉碎后于-20 ℃冰箱保存。

1.3.2 红烧肉中AM含量的测定

1.3.2.1 前处理条件

根据参考文献[25]建立的方法进行红烧肉中AM的测定。准确称取0.5 g已均质红烧肉样品，加入5 μL13C3-AM标准溶液（10 μg/mL），然后加入2 mL体积分数0.1%甲酸溶液，漩涡30 s进行提取，加入4 mL氯仿-甲醇溶液（2∶1，V/V）脱去脂肪，振摇提取30 min后，5 000 r/min离心10 min，取上清液，重复提取一次后合并上清液。最后采用固相萃取柱Oasis HLB SPE柱（6 mL、200 mg）进行样品的净化、富集。

1.3.2.2 液相色谱-串联质谱测定AM含量

色谱柱：Hydro RP 80A HPLC柱（2 mm×250 mm，4 μm）；流动相：甲醇-0.1%甲酸溶液（5∶95，V/V）；流速0.2 mL/min；柱温25 ℃；进样量10 μL。电喷雾离子源；正离子模式；干燥气温度350 ℃；干燥气流速11 L/min；雾化压力 45 psi；鞘气温度400 ℃；鞘气流速11 L/min；喷嘴电压 500 V；毛细管电压3000 V；裂解电压20 V；扫描方式：多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式；检测AM：定量分子离子m/z72→55、定性碎片离子m/z72→27，13C3-AM：定量分子离子m/z75→58、定性碎片离子m/z75→29。AM和13C-AM的质谱图和色谱图如图1所示。

图1 AM（A）和13C-AM（B）的质谱图和色谱图Fig.1 Mass spectra and chromatograms of AM (A) and 13C-AM (B)

1.3.3 红烧肉中TFAs相对含量的测定

1.3.3.1 脂肪的提取

参照Folch等[26]的方法进行，具体如下：称取500 mg的已均质红烧肉样品置于15 mL的离心管中，加入7 mL的氯仿-甲醇溶液（2∶1，V/V）振摇抽提1.5 h后继续超声10 min，过滤，向滤液中加入1 g/100 mL NaCl溶液3.5 mL，静置分层，弃掉上层液体，将含有下层氯仿液的离心管于40 ℃下进行氮吹，浓缩得到的脂肪再置于105 ℃下烘干至恒质量。

1.3.3.2 脂肪酸甲酯化

参照本实验室建立的方法[27]进行脂肪酸的甲酯化，准确称取10 mg脂肪样品于离心管中，分别加入10 μL 4.5 mg/mL的C21:0内标液、2 mL正庚烷和0.1 mL 2 mol/L氢氧化钾甲醇溶液。振摇30 s，3000 r/min离心5 min，取1 mL上清液置于气相瓶待测。

1.3.3.3 气相色谱条件

采用安捷伦CP-Sil 88型毛细管色谱柱（100 m×0.25 mm，0.20 μm），氢火焰离子检测器（flame ionization detector，FID），进样量为1 μL，高纯氢气为载气，进样口温度和检测器温度均为250 ℃，恒流模式，分流比为10∶1，氢气流量为30 mL/min，空气流量为300 mL/min，尾吹气流量为20 mL/min，载气线速为26 cm/s。升温程序为：初温60 ℃，保持5 min，以11.5 ℃/min升至170 ℃，保持25 min；再以5 ℃/min的速率升至200 ℃，保持5 min；最后以2 ℃/min升温至215 ℃，保持20 min。脂肪酸甲酯混标的色谱图如图2所示，峰的编号对应的名称如表1所示。

图2 脂肪酸甲酯混合标准品的气相色谱图Fig.2 Gas chromatogram of mixture of fatty acid methyl ester standards

表1 脂肪酸甲酯标准品的出峰时间Table 1 Peak appearance times of fatty acid methyl ester stadards

按照文献[28]提供的公式（式（1）～（3））计算TFAs的相对含量。

式中：mFAMEx表示脂肪酸甲酯的质量/g；Ax脂肪酸x的峰面积；mis表示加入样品中内标的质量/g；Ais表示内标的峰面积；Rx表示脂肪酸甲酯相对于内标的FID的校正因子；mx表示脂肪酸x的质量/g；FFAx表示脂肪酸甲酯转化为相应脂肪酸的转化因子；P表示样品中TFAs在总脂肪酸中的相对含量；∑transmx表示样品中总TFAs的质 量/g；∑mx表示样品中总脂肪酸质量/g。

1.3.4 红烧肉中呋喃含量的测定

1.3.4.1 前处理条件

通过本实验室已经建立的顶空GC-MS法[3]来测定红烧肉样品中呋喃的含量。在4 ℃下称取3 g已均质红烧肉样品于20 mL顶空瓶中，加入5 mL 1 g/100 mL NaCl溶液和40 μL D4-呋喃内标溶液（2.5 μg/mL）。用封口钳封盖，待测。

1.3.4.2 GC-MS测定呋喃含量

GC条件：样品进样体积1 mL，加热时间30 min，加热温度70 ℃；进样针温度110 ℃；色谱柱为HP-PLOT Q石英毛细管色谱柱（30 m×0.32 mm，20 μm）；进样口温度：200 ℃；升温程序：起始温度为50 ℃，保持1 min 后以10 ℃/min升温速率升至200 ℃，保持10 min；载气：高纯氦气，流速为1.5 mL/min；分流比为3∶1。

MS条件：离子源：高灵敏度电子轰击离子源，电子能量70 eV；离子源、四极杆和传输线的温度分别为230、150 ℃和260 ℃；溶剂延迟：8 min。采用选择性离子监测模式（selected ion monitoring，SIM）进行测定，检测呋喃：定量分子离子m/z68、定性碎片离子m/z39，D4-呋喃：定量分子离子m/z72、定性碎片离子m/z42。呋喃和D4-呋喃的质谱图和色谱图如图3所示。

图3 呋喃（A）和D4-呋喃（B）的质谱图和色谱图Fig.3 Mass spectra and chromatograms of furan (A) and D4-furan (B)

1.4 数据处理与分析

每组实验重复3 次，用Excel来处理数据，结果均采用平均值±标准差的形式，利用OriginPro 8软件作图。

2 结果与分析

2.1 竹叶抗氧化剂对红烧肉中典型危害物形成的影响

AOB中含有绿原酸、咖啡酸、荭草素和异荭草素等活性物质，体内体外实验均表明AOB具有清除自由基、抗脂质过氧化以及提升体内抗氧化水平的作用。由图4A可知，AOB的添加会不同程度地促进红烧肉中AM的形成，其促进效果由高到低排序为：0.2 g/L AOB＞0.1 g/L AOB＞0.5 g/L AOB＞0.15 g/L AOB。当添加0.2 g/L AOB溶液时，红烧肉中AM含量是空白组的近两倍。这一发现与焙烤、油炸食品的结果相反。Zhang Yu等发现0.10% AOB溶液对鲜切马铃薯片AM的抑制率为74.1%，对炸薯条AM的抑制率为76.1%[29]。程璐发现在曲奇饼干中添加0.10～0.50 g/kg AOB时，对AM的抑制率可达43.0%～60.1%[30]。在不同食品体系中，AOB对AM的形成产生了抑制和促进两种结果，这主要是因为在富含碳水化合物的油炸模型中，AM主要是通过天冬酰胺和还原糖发生美拉德反应生成，AOB可以抑制美拉德反应中Amadori产物的生成，从而抑制薯片中AM的生成[31]。而五花肉中虽然碳水化合物的含量很低，但富含蛋白和脂肪，AM可以通过油脂热分解、肌肽水解脱氨以及丝氨酸和半胱氨酸降解等多种途径产生，AOB中绿原酸、咖啡酸等活性物质可能不能抑制上述反应，还会因为在高温环境下裂解产生活性羰基，促进丙烯醛和丙烯酸的生成，从而促进AM生成[30]，因此在红烧肉体系中AOB对AM产生促进作用。

图4 不同质量浓度的AOB溶液对红烧肉中AM、TFAs 和呋喃水平的影响Fig.4 Effects of antioxidant of bamboo leaves (AOB) at different concentrations on the contents of AM, TFAs and furan in red braised pork

由图4B可知，不同添加量的AOB均会促进红烧肉中TFAs的生成，且存在剂量依赖性。空白组中TFAs在油脂中的相对含量为0.25%，而添加0.5 g/L的AOB水溶液后，TFAs相对含量为0.35%，增加了40%。烹饪过程中使用的植物油中含有TFAs，同时植物油和五花肉中油脂氧化和不饱和脂肪酸异构化可能形成TFAs。李安研究发现在大豆油中添加耐热性好的抗氧化剂是控制TFAs生成的有效措施[32]。AOB中含有的绿原酸、咖啡酸等活性物质不具有耐热性，因此推测其无法抑制红烧肉中TFAs的生成。此外，AOB促进红烧肉中TFAs生成的机理需要进一步探究。

由图4C可知，不同添加量的AOB均能抑制体系中呋喃的生成，但与AOB质量浓度不呈绝对的正相关，添加0.2 g/L AOB时呋喃的含量最低（3.71 ng/g），抑制率最大（72.7%）。刘玲玲[24]研究发现五花肉中抗坏血酸、碳水化合物、类胡萝卜素（呋喃形成的主要前体物质）的含量均很低，而脂肪中的多不饱和脂肪酸相对含量为10.8%，并且在水焯过程中多不饱和脂肪酸的相对含量降低16.7%，而在爆炒阶段多不饱和脂肪酸相对含量又显著上升；因此多不饱和脂肪酸的降解是红烧肉可能是形成呋喃的主要途径。AOB中的活性物质可以有效抑制脂质过氧化，因此可以有效控制红烧肉中呋喃的产生。

2.2 茶多酚对红烧肉中典型危害物形成的影响

茶多酚是茶叶中所含的一类多羟基酚类化合物，其活性成分主要是儿茶素，具有较强的消除自由基、解毒和抗辐射作用。由图5A可知，茶多酚的添加可以抑制红烧肉中AM的生成。添加的茶多酚质量浓度在0～0.15 g/L 范围内增加时，红烧肉中AM含量呈线性下降；当茶多酚质量浓度为0.15 g/L时，AM的含量最低，抑制率可达47.8%；当质量浓度超过0.15 g/L时，AM含量明显上升。高温下油脂热解以及氨基酸的降解都会产生小分子的中间体，如乙二醛和甲基乙二醛等，而茶多酚的主要成分——儿茶素可以通过清除二羰基化合物间接减少AM的形成，同时茶多酚因其有酚羟基可以捕获油脂降解产生的自由基，从而抑制AM的形成[33-34]。而当茶多酚质量浓度过高时，茶多酚可以为AM的形成提供活性羰基进而促进AM的生成[30]。因此茶多酚对红烧肉中AM的抑制作用与其质量浓度相关，超过最佳质量浓度范围后其抑制AM的效果会被减弱。

图5 不同质量浓度的茶多酚溶液对红烧肉中AM、TFAs 和呋喃水平的影响Fig.5 Effects of tea polyphenols at different concentrations on the contents of AM, TFAs and furan in red braised pork

由图5B可知，添加茶多酚后，TFAs的变化趋势与AM相同，整体呈现抑制效果。在茶多酚的添加量小于0.15 g/L时，TFAs含量随茶多酚质量浓度增加而明显降低，随后又随其质量浓度的增加呈上升趋势。茶多酚的质量浓度为0.15 g/L时，对红烧肉体系TFAs的抑制效果最好，抑制率达到19.1%。除了食用油本身含有TFAs外，红烧肉加热过程中不饱和脂肪酸异构化会产生TFAs。杨滢研究了茶多酚对大豆油中TFAs的影响，发现茶多酚对TFAs有很好的抑制效果[35]。因此茶多酚可以通过抑制不饱和脂肪酸异构化，从而抑制红烧肉中TFAs的形成。当茶多酚质量浓度超过最佳浓度范围后，其对TFAs的抑制效果降低，而抑制效果减弱的具体原因需要进一步的研究。

由图5C可知，不同添加量（0.1～0.5 g/L）的茶多酚均能促进红烧肉中呋喃的生成，但是添加的质量浓度与呋喃生成没有明显的线性关系。这一结果与Bi等的研究结果不同，其证明在罐装咖啡模型中添加12.1%茶多酚可以抑制42.4%的呋喃生成[21]，这可能是食品基质以及抗氧化剂的添加量不同所导致的。Shen Mingyue等在亚油酸、亚麻酸模型中添加表没食子儿茶素没食子酸酯，发现表没食子儿茶素没食子酸酯在亚油酸模型中能有效抑制呋喃的生成，而在亚麻酸模型中却没有明显的 影响[36]。说明茶多酚对呋喃的影响与实际的食品体系有很大关系，其影响机理需要进一步的研究。

2.3 迷迭香酸对红烧肉中典型危害物形成的影响

迷迭香酸是一种多酚羟基的酸，具有抗氧化及清除自由基的作用。由图6A可知，当迷迭香酸的质量浓度在0～0.2 g/L范围时会促进红烧肉中AM的生成，而当质量浓度达到0.5 g/L时，迷迭香酸的加入会抑制红烧肉中AM的生成。这一结果与富含碳水的模型不同，刘黄友通过果糖-天冬酰胺模型推测了迷迭香酸抑制AM的3 种抑制机理：1）迷迭香酸作为一种酸可以降低AM的前体物质Shiff碱的形成；2）迷迭香酸及其热解产物能与果糖等含有羟基的前体物质发生酯化；3）迷迭香酸具有强抗氧化性，能与AM直接加成，从而降低体系中的AM总量[37]。在红烧肉体系中AM的前体物质主要是蛋白质和脂肪，两者通过形成中间产物——丙烯酸，最终生成AM。迷迭香酸作为酸可以使脂肪水解成甘油和高级脂肪酸而非丙烯酸，也可抗氧化剂抑制油脂氧化，因此在一定质量浓度下可以抑制红烧肉中AM的形成；但其促进AM生成的原因还需进一步探究。

图6 不同质量浓度迷迭香酸溶液对红烧肉中AM、TFAs 和呋喃水平的影响Fig.6 Effects of rosmarinic acid at different concentrations on the contents of AM, TFAs and furan in red braised pork

由图6B可知，迷迭香酸对红烧肉体系中TFAs的影响呈现出低质量浓度促进、高质量浓度抑制的效果。当迷迭香酸的添加量为0.1 g/L时，红烧肉中TFAs的相对含量增加，表现出促进效果；而当迷迭香酸的浓度提高到0.15 g/L后，迷迭香酸会抑制红烧肉中TFAs的生成。陈玉等在稻米油中添加0.020%的迷迭香提取物，经过煎炸后TFAs含量增加[38]。而李安发现0.040%迷迭香提取物可以抑制大豆油加热过程中TFAs的形成，因为迷迭香酸可以抑制不饱和脂肪酸异构化产生TFAs[32]。因此迷迭香酸在不同食品基质、不同的添加水平时对TFAs的作用效果不一样。

由图6C可知，0.1、0.15、0.2、0.5 g/L迷迭香酸对红烧肉中呋喃均有抑制效果，抑制率分别为18.7%、28.9%、33.3%和38.4%。因为多不饱和脂肪酸的热氧化是形成呋喃的一条重要途径，而迷迭香酸可以与过氧基结合，阻止连锁反应继续进行，减缓脂质过氧化的速度，进而抑制呋喃的形成[39]。

3 结 论

本实验研究了3 种天然植物抗氧化剂对中式菜肴红烧肉热加工过程形成的3 种典型危害物的作用。结果表明，在红烧肉的烹饪过程中，不同的抗氧化剂对各危害物的影响程度有较大差异。AOB能有效抑制红烧肉体系中呋喃的形成，但是会促进TFAs和AM的产生；茶多酚能有效抑制体系中TFAs和AM的形成，且均在茶多酚质量浓度为0.15 g/L时的抑制效果最好，然而会促进呋喃产生；迷迭香酸对于体系中呋喃形成有抑制作用，且存在明显的剂量依赖关系，对于TFAs和AM而言，却表现出低质量浓度时促进、高质量浓度时抑制的作用。因此选用0.5 g/L的迷迭香酸可以有效控制红烧肉中的3 种典型的热加工危害物。本研究为抑制中式菜肴中的危害物提供了理论技术参考。