胰蛋白酶制备乌贼缠卵腺抗氧化活性多肽的研究

周勰 叶捷娜 张林佳 黄芳芳 杨最素

摘要 [目的]探讨胰蛋白酶制备乌贼缠卵腺抗氧化活性多肽的工艺及体外抗氧化活性。[方法]以乌贼缠卵腺为原料，用胰蛋白酶进行酶解，采用单因素和正交试验优化乌贼缠卵腺抗氧化活性肽的提取工艺;将酶解液超滤分成4个分子段，通过体外检测DPPH清除率、·OH清除率和还原力评价其抗氧化活性。[结果]胰蛋白酶酶解乌贼缠卵腺在加酶量2 000 U/g、pH为8.5、料液比1∶3、酶解时間8 h条件下得到的酶解物对DPPH的清除率最大。酶解液经超滤得到的<3 kD分子段的多肽具有良好的DPPH清除能力、·OH清除能力和还原能力。[结论]胰蛋白酶酶解制备的乌贼缠卵腺多肽具有较好的体外抗氧化活性，可作为抗氧化肽的理想来源。

关键词 乌贼缠卵腺;多肽;胰蛋白酶;酶解;抗氧化活性

中图分类号 TS 254.9  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2021）16-0183-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.16.049   开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Study on Preparation of Antioxidant Activity Polypeptide from Cuttlefish Ovary Gland by Trypsin

ZHOU Xie，YE Jie-na，ZHANG Lin-jia et al （Zhejiang Engineering Research Center for Marine Biomedical Products，School of Food and Pharmacy，Zhejiang Ocean University，Zhoushan，Zhejiang 316022）

Abstract [Objective] To explore the conditions for the preparation of antioxidant peptides from the nidamental glands of cuttlefish by trypsin and study the antioxidant activities of the enzymatic hydrolysates  in vitro. [Method] The nidamental glands of cuttlefish were used as raw materials and hydrolyzed by trypsin.Single-factor and orthogonal tests were used to optimize the extraction process for anti-oxidant peptides from the nidamental glands of cuttlefish.The enzyme hydrolysate was ultrafiltered into 4 molecular segments，and its antioxidant activity was evaluated by  in vitro  detection of DPPH clearance rate，·OH clearance rate and reducing power.[Result] The optimized conditions were as follows： volume of enzyme of 2 000 U/g，pH of 8.5，solid-liquid ratio of 1∶3 and hydrolysis time of 8 h.Peptides with a Mw of less than 3 kD exhibited appreciable antioxidant activities，including DPPH scavenging，·OH scavenging and reducing activities.[Conclusion]The peptides from the nidamental glands of cuttlefish by trypsin had excellent antioxidant activities  in vitro  and could be an ideal source of antioxidant peptides.

Key words Nidamental gland of cuttlefish;Peptides;Trypsin;Enzymatic hydrolysis;Antioxidant activity

人体内自由基的生成和清除一般处于动态平衡状态，过多的自由基会干扰这种平衡，从而产生氧化应激反应并引起炎症、糖尿病等疾病[1]。化学合成的抗氧化剂已普遍应用于生物医学产品、日用化妆品和食品等行业[2]。然而化学合成的抗氧化剂对人体健康有潜在的毒性，因此，开发安全有效的天然抗氧化剂已引起人们的广泛关注[3]。近年来，越来越多动植物来源的多肽已被证实具有清除自由基的能力[4]，这为开发新型抗氧化剂提供了新的思路。研究表明，通过酶解大分子蛋白得到的抗氧化肽通常具有抗氧化活性强、生物安全性等优势[5]。海洋蛋白是制备抗氧化活性肽的高质量原料。鲍鱼内脏、鲤鱼鱼鳞等海洋生物蛋白已被报道用于制备具有良好抗氧化活性的多肽[6-7]。

乌贼肉质细腻脆口、营养丰富，且具有很高的医用价值，备受消费者青睐。但在乌贼加工的过程中，会产生乌贼内脏、乌贼皮、乌贼墨和乌贼骨等大量副产物，近年来研究发现从这些副产物中可以提取大量的具有抗氧化、抗炎等活性的产物[8]。乌贼缠卵腺作为乌贼加工的副产物之一，已被报道用于制备具有抗疲劳、提高免疫功能的生物活性物质[9]。乌贼缠卵腺的舍弃是对蛋白质资源的一种极大耗损。该研究通过单因素和正交试验优化胰蛋白酶酶解乌贼缠卵腺制备抗氧化肽的工艺，并通过测定DPPH清除率、·OH清除率以及还原力探究不同分子量酶解产物的抗氧化活性。

1 材料与方法

1.1 试验材料 新鲜雌乌贼内脏，购自舟山农贸市场。胰蛋白酶（酶活250 U/g），购自北京亚太恒信生物科技有限公司;DPPH、铁氰化钾、邻二氮菲，购自上海晶纯试剂有限公司;其他常用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备 HWS-24数显恒温水浴锅（山东城创新仪器有限公司）;Cogent u Scale超滤系统（美国密理博公司）;pHS-250 pH计（上海理达仪器厂）;UV-1600PC紫外分光光度计（上海美谱达解仪器有限公司）;CF16RN高速冷冻离心机（日立仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 乌贼缠卵腺抗氧化活性肽制备工艺。取乌贼缠卵腺，去除周围其他组织，捣碎成匀浆液→调料液比→调pH→胰蛋白酶酶解（37 ℃）→灭酶活（沸水浴10 min）→离心（12 000 r/min，15 min）→取上清液→冷冻干燥。

1.3.2 单因素试验。该试验以加酶量（1 000、1 500、2 000和2 500 U/g）、pH（7.5、8.0、8.5和9.0）、料液比（1∶1、1∶2、1∶3和1∶4）和酶解时间（2、4、6和8 h）为影响因素进行单因素试验，以游离氨基氮（ANN）含量为指标，来确定胰蛋白酶酶解的条件范围。该试验除被考察的单因素外，其他3因素均为相同的固定值（加酶量为1 500 U/g、pH为8.0、料液比为1∶3、酶解时间为8 h）。ANN含量与水解度呈正相关。ANN含量用甲醛电位滴定法测定[10]。

1.3.3 正交试验优化乌贼缠卵腺抗氧化活性肽提取工艺。根据单因素试验结果，考虑到pH、时间、加酶量、料液比4个因素，选取L 9（34）正交试验记录表，以DPPH清除率评价酶解液的抗氧化活性。因素和水平见表1。

1.3.4 超滤截留。取冷冻干燥的乌贼缠卵腺酶解液，用超滤系统进行超滤分段，得到4个不同分子段的提取液，分别为<3 kD、3～10 kD、>10～30 kD、>30 kD。将各分子段的超滤液进行冷冻干燥，测定其体外抗氧化活性。

1.3.5 体外抗氧化能力的测定。DPPH清除率[11]、·OH清除率[12]、还原力[13]的检测参照文献进行并适当改进。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 加酶量对乌贼缠卵腺酶解物的ANN含量的影响。从图1可以看出，随着胰蛋白酶添加量的持续增加，酶解物的ANN含量先上升后下降。在加酶量为2 000 U/g时，ANN含量到达最高值。当加入少量胰蛋白酶時，底物会和胰蛋白酶充分结合，加酶量越大，底物水解越充分。但当胰蛋白酶超过一定量后，过多的酶分子会抑制中间产物转化成终产物[10]。因此选择加酶量1 500、2 000、2 500 U/g进行后续正交试验。

2.1.2 pH对乌贼缠卵腺酶解物的ANN含量的影响。从图2可以看出，随pH的增加，酶解物的ANN含量先增加后降低。胰蛋白酶的pH过高或过低都会导致酶活性降低，从而影响底物的水解[14]。因此选择pH为7.5、8.0、8.5进行后续正交试验。

2.1.3 料液比对乌贼缠卵腺酶解物的ANN含量的影响。从图3可以看出，当料液比持续增加，酶解物的ANN含量先上升后下降。在料液比为1∶3时，酶解物的ANN含量到达最高值。这可能是因为酶解过程中较小的料液比使底物浓度降低，从而导致酶促反应的速度降低，酶解产物减少。因此选择料液比为1∶1、1∶2、1∶3进行后续正交试验。

2.1.4 酶解时间对乌贼缠卵腺酶解物的ANN含量的影响。从图4可以看出，酶解时间越长，酶解物的ANN含量越高。当酶解时间为8 h时，酶解物的ANN含量最高。所以选择酶解时间为4、6、8 h进行后续正交试验。

2.2 正交试验 为进一步优化乌贼缠卵腺抗氧化活性肽的制备工艺，进行了正交试验，结果见表2。从表2可以看出，影响胰蛋白酶酶解产物DPPH清除率的各因素排序为D>A>C>B，即酶解时间>加酶量>料液比>pH，其中酶解时间的影响最大，pH的影响最小。在组合为A 2B 3C 3D 3即加酶量为2 000 U/g、pH为8.5、料液比为1∶3、酶解时间为8 h时，酶解物的DPPH清除率最高。

2.3 超滤截留 通过超滤将乌贼缠卵腺的酶解物分为分子量<3 kD、3～10 kD、>10～30 kD、>30 kD的多肽，其抗氧化能力如图5所示。与其他超滤组分相比，<3 kD的组分具有最高的DPPH清除率、·OH清除率和还原力。研究表明，低分子量的蛋白质水解产物具有较强的抗氧化活性[15]。因此，选择分子量<3 kD的组分用于后续抗氧化活性的评估。

2.4 抗氧化活性的评估

2.4.1 DPPH清除率的测定。由图6可知，<3 kD分子段多肽随着其浓度的升高，DPPH清除率也升高;当多肽浓度为16 mg/mL时，清除率达到最大，最大清除率为90.95%。而阳性对照抗坏血酸（V C）的DPPH清除率都在95%～100%。所以<3 kD的乌贼缠卵腺抗氧化肽具有良好的DPPH清除能力。

2.4.2 ·OH清除率的测定。由图7可知，阳性对照V C组随浓度的增加，其对·OH的清除率增加，增加幅度较大;当V C浓度为16 mg/mL时，·OH清除率最大达到84.07%。<3 kD 分子段多肽随浓度的增加，·OH清除率也呈上升趋势，在多肽浓度为16 mg/mL时达到最大清除率63.61%，但其增加幅度较阳性对照组低。因此<3 kD的乌贼缠卵腺抗氧化肽具有较好的·OH清除率。

2.4.3 还原力的测定。由图8可知，<3 kD分子段多肽随着浓度的升高，其还原力值逐渐升高。在浓度为16 mg/mL时，还原力达到最大值（0.284）。但同等浓度下的抗坏血酸的还原能力要强于<3 kD的乌贼缠卵腺抗氧化肽的能力。因此<3 kD的乌贼缠卵腺抗氧化肽有较好的还原能力。

3 结论

该试验结合单因素和正交试验筛选出胰蛋白酶提取乌贼缠卵腺抗氧化活性多肽的最优条件：加酶量为2 000 U/g，pH为8.5，料液比为1∶3，酶解时间为8 h。酶解液通过超滤得到4个不同分子段，分别为<3 kD、3～10 kD、>10～30 kD、>30 kD。通过检测DPPH清除率、·OH清除率和还原力，发现<3 kD分子段多肽具有最佳的抗氧化活性。该研究结果表明乌贼缠卵腺抗氧化活性多肽具有良好的抗氧化活性，可作为天然抗氧化剂，在生物医学、日用化妆品和食品行业有一定的开发利用价值。

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