8个新收集大白菜杂交种DNA指纹构建及其与已有种质的亲缘关系分析

刘栓桃，王立华，张志刚，王荣花，王树彬，李巧云，赵智中

（山东省农业科学院蔬菜研究所／国家蔬菜改良中心山东分中心／山东省设施蔬菜生物学重点实验室／农业部黄淮地区蔬菜科学观测实验站（山东），山东 济南 250100）

大白菜（Brassica rapassp.pekinensis）是山东省的优势蔬菜，为常异交作物，杂种优势非常明显，因此杂交种在生产实践中的普及率较高。由于消费需求不断变化且呈现出多样化的特点，近年来衍生出很多新的大白菜品种，如快菜，苗期生长迅速、无毛、叶肉厚，莲座期叶片直立性好，食用器官就是莲座期的叶片；绍菜，日本进口品种，中棵直筒型；娃娃菜，叶球体积小食用器官为莲座叶、合抱类型，适宜运输；黄心秋白菜，近年来新出现的类型，且心叶颜色越黄越受欢迎。

对于新涌现的品种类型，有必要了解其与已有品种或种质资源之间的亲缘关系，这对掌握其亲本类型、培育自主知识产权的新品种有非常大的帮助。前人对大白菜遗传多样性、种质资源亲缘关系等方面的研究已经有很多报道，如RAPD［1，2］、AFLP［2，3］、SSR［4－7］和SRAP［8］等标记类型均被用于鉴定大白菜种质的亲缘关系。随着高通量测序技术的发展，很多物种的参考基因组序列已经公布，大白菜参考基因组序列也已经释放［9］，以全基因组重测序技术为基础的新型分子标记如 InDels标记、SNP 标记得到普遍应用［10，11］。尤其是InDels标记，它在基因组中一般呈共显性分布，且其在基因组中的位置清楚、变异稳定，这是RAPD、AFLP、SSR等标记不能比拟的［5］。

本课题组已经开发了适宜大白菜种质资源和杂交种指纹构建的核心引物［12，13］，前期已经对105份大白菜育种材料和72个杂交种进行了DNA指纹分析，本研究将在此基础上，构建8个新收集大白菜品种的DNA指纹，进一步充实大白菜杂交种DNA指纹数据库，同时分析这些杂交种与已有育种材料和杂交种之间的亲缘关系，为加快新种质利用和创制大白菜新种质提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为市售8个大白菜新品种（见表1）。分别是娃娃菜新品种耐寒金皇后、玲珑黄012，抗根肿病合抱类新品种CR新美，合抱类型黄心秋白菜新品种12CC4912、金德丽和梅赛德斯，绍菜新品种墨玉青，直筒类新品种御菜。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取 每个品种随机选取20粒种子，参考刘栓桃等［14］的方法准备幼苗，即种子用蒸馏水清洗后置于垫有发芽纸的发芽盒内，于8 000 lx的光照培养箱内16 h光照／8 h黑暗、28℃恒温处理72 h。然后每个品种选取10棵子叶展开的幼苗，混匀后液氮研磨，取50 mg粉末加入200μL TPS提取液于65℃恒温箱保温30～60 min，随后冷却至室温，12 000 r／min离心10 min；将上清转移至新的离心管中，加入等体积异丙醇使DNA沉淀，12 000 r／min离心10 min，弃上清。DNA沉淀用75%酒精清洗后于室温干燥10 min，用200μL 10 mmol／L的Tris－HCl（pH 8.0）溶解，4℃保存备用。

1.2.2 DNA指纹构建 所用20对核心引物以及PCR 反应体系均参考本课题组前期的研究［13］。PCR扩增产物用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色，数码相机拍照。DNA指纹构建参考刘栓桃等［13］的方法，将引物按照染色体编号和物理位置由小到大排列，如果某样本扩增产物为单一的、相对迁移率较大的条带则赋值0，如果扩增产物为单一的、相对迁移率较小的条带则赋值1，如果同时扩增出两条带则赋值H。

1.2.3 与已有育种材料和大白菜品种的亲缘关系分析 以核心引物的扩增结果为依据，从前期研究中筛选105份大白菜育种材料和72个大白菜杂交种的DNA指纹赋值结果，这些材料的编号、名称详见有关文献［12，13］。参照刘栓桃等［14］的方法将DNA指纹转换为核酸碱基，即赋值1转换为AA，赋值0转换为GG，赋值H转换为AG，将生成的核酸序列文件用MEGA 7.0软件［15］以最大似然法构建亲缘关系树。

2 结果与分析

2.1 大白菜新品种DNA指纹构建

图1是核心引物IDA01054以及IDA02042的扩增结果及赋值示例。依据图示的赋值标准将20对引物的扩增结果赋值，所得8个品种的DNA指纹如表1所示。经过比对，8个新品种之间没有重复指纹。

表1 8个新品种的DNA指纹

2.2 新收集品种与已有大白菜品种及育种材料的亲缘关系分析

新收集的8个品种与已有品种及育种材料［12，13］的亲缘关系如图2所示。可以发现，耐寒金皇后（NF－1）、梅赛德斯（NF－6）与2019年收集的玲珑黄515（WS14）、寒鲜（WS16）以及长胜（WS19）三个耐抽薹大白菜亲缘关系比较近，与本课题组创制的合抱类春白菜育种材料06－247（R001）、2016－185－3（R100）以及引自韩国的春材料2017－YM59（R085）也有比较近的亲缘关系。玲珑黄012（NF－2）与2019年收集的一个中棵娃娃菜（WS12）、抗根肿病娃娃菜CR－黄心（WS20）、CR－金丽（WS05）、CR－民喜（WS06）、CR－天盛（WS10）都比较接近，与从韩国引进的春白菜材料2016－XC25（R089）有较近的亲缘关系。CR新美（NF－3）和直筒类新品种御菜（NF－8）与我国育成的直筒类品种天香80青麻叶（WS27）、北京新三号（F1－13）、中白62号（F1－36）、天白75（F1－31）有较近的亲缘关系，但与本课题组已经鉴定的105份育种材料都没有比较直接的亲缘关系。新收集的合抱类秋白菜12CC4912（NF－4）和金德丽（NF－5）两个比较相似，与我们创制的叠抱类秋材料2016－133－3（R092）和2011－ZC39（R103）有一定的亲缘关系。墨玉青（NF－7）与之前收集的品种亲缘关系不大，与我们创制的合抱类秋材料2017－YM12（R082）有一定的亲缘关系。总体上，新收集的8个品种、2019年收集的32个新品种与课题组创制的合抱类材料亲缘关系更近，与叠抱类材料亲缘更远。

图2 新收集品种与已有品种和种质之间的亲缘关系聚类结果

3 讨论与结论

大白菜新品种采用登记制，新品种登记之前必须进行特异性、一致性和稳定性测试（即DUS测试），而DUS测试基本以田间种植和调查为主，由农业农村部委托有资质的机构进行［16］。一个新品种在进行DUS测试时，会要求新品种提供者同时提供一个与该新品种相近的对照品种，测试机构按照DUS测试指南的要求，在1～2个生育期内对新品种及其对照品种进行相应指标的调查记录，出具测试报告。由于新品种育成单位对自己选育的新品种以及市场已经销售的品种有比较多的了解，因而在选择对照品种时很可能会有意识地避免选择各方面性状与自己品种接近的已有品种，而更倾向于选择一个与自己品种各方面性状差异比较大的作为对照，这样比较容易得到一个符合规定的DUS测试结果，使新品种能尽快进行相关登记而推向市场，从而使新品种选育单位实现利益最大化。更有甚者，可能将相同的品种进行不同的命名，同时委托不同的DUS测试机构进行测试，最终以同种异名进行品种登记而销售，迷惑市场和种植者。解决上述问题的唯一办法就是应收尽收地收集所有已经在中国市场登记和销售的大白菜新品种并构建其DNA指纹数据库。对于一个新选育的品种，进行DUS测试的同时构建其DNA指纹，并与数据库中已有的指纹进行比对，将DUS测试结果与DNA指纹比对结果相结合，真正让有创新的品种进入登记环节并推向市场。

本课题组前期构建了72个大白菜杂交种的DNA指纹数据库［13］，这为开展新育成大白菜杂交种的DNA指纹比对工作奠定了基础。本研究对新收集的8个大白菜杂交种与已有品种DNA指纹进行比对，发现了与已有品种近似的品种，但没有发现完全相同的品种，表明新收集的这8个新品种有一定的利用价值。尤其值得注意的是，本研究利用DNA指纹比对技术将新品种与本课题组已经创制的育种材料进行比对，明确了新品种与已有育种材料之间的亲缘关系，今后再进一步结合田间鉴定结果，可以将新收集品种的优良性状转移至亲缘关系更近的育种材料中，这对指导新种质创制有一定的借鉴意义。

本课题组创制的材料中叠抱类秋材料比较丰富，合抱类春、秋材料相对比较少。合抱类品种由于长途运输方便，比较受市场的欢迎，因此近年来我们侧重于收集合抱类新品种，以创制合抱类育种材料。从本研究鉴定结果发现，2019年收集的WS01～WS32以及本研究收集的8个新品种，均与合抱类型材料的亲缘关系较近，而与本课题组已有的叠抱类型材料亲缘关系较远，这对今后选育合抱类白菜新品种有重要的利用价值。

总之，本研究构建了新收集的8个大白菜新品种的DNA指纹，充实了大白菜杂交种DNA指纹数据库，同时分析了这8个新品种与已有品种以及本课题组已有育种材料之间的亲缘关系，为充分利用这些新品种的优良性状改造已有育种材料、避免系谱关系混杂提供了分子证据。