肝X受体激动剂TO901317对糖尿病视网膜病变大鼠视网膜的保护作用△

丁剑锋 杨炜 李璐 司超

糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病主要慢性并发症之一，其与视网膜炎症、氧化应激及微血管病变密切相关。DR可引起视网膜炎症和微血管病变，进而导致糖尿病患者视力减退甚至致盲[1-4]。目前针对DR的主要治疗方式为玻璃体内注射抗VEGF药物，但其价格昂贵，导致患者经济负担加重。因此开发疗效更好、性价比更高的药物对于预防和治疗DR十分必要。

肝X受体为一种核受体，其激动剂TO901317可以通过启动ABCA1转录，抑制核因子κB活性，从而下调白细胞介素(IL)-1β、IL-6、iNOS、COX2等炎症因子表达，上调抑炎因子IL-10的表达，进而在脑、肺和视网膜等组织器官发生缺血缺氧损伤时发挥一定的抗炎作用[5-9]。研究证明，IL-1β、IL-6和VEGF是DR患者视网膜新生血管形成的关键影响因素[10-12]，本课题组前期研究也发现，激活ABCA1能抑制 IL-1β 的表达，在缺血缺氧刺激因素作用下对视网膜神经节细胞有一定的保护作用[13]。但肝X受体激动剂TO901317与DR的发生发展是否有密切关系目前鲜有报道。本研究通过分析TO901317对DR模型大鼠视网膜组织形态、新生血管形成及视网膜ABCA1、IL-1β、IL-6和VEGF表达的影响，探讨TO901317对DR大鼠视网膜的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物取24只健康SPF级SD大鼠(购于新疆医科大学实验动物中心)，雌雄不拘，体重180～220 g，鼠龄8～12周，随机分为正常组、模型组、TO901317组，每组各8只。动物饲养于石河子大学医学院动物实验中心，饲养温度22～25 ℃，饲养湿度45%～55%，实验动物在安静环境下自由进食和饮水。饲养及实验过程严格按照《石河子大学医学伦理委员会条例》进行。

1.1.2 实验试剂及仪器RNeasy Mini Kit 试剂盒(德国 Qiagen 公司)，β-actin一抗、二抗(北京中杉金桥公司)，ABCA1、VEGF、IL-1β、IL-6一抗和TO901317(美国 Sigma公司)，ABCA1、VEGF、IL-1β、IL-6引物(上海生工生物工程有限公司)，逆转录试剂盒、Q-PCR试剂盒(美国 Promega公司)，IL-1β 、IL-6 ELISA试剂盒(美国ADL公司)，CFX96Touch实时荧光定量PCR 检测系统、电泳仪、电转仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 各组大鼠处理正常组大鼠不做任何处理；模型组、TO901317组大鼠在禁食24 h后测量空腹血糖浓度，腹腔内注射链脲佐菌素60 mg·kg-1，1周后采尾静脉血检测空腹血糖浓度。此后每月检测空腹血糖浓度1次，以空腹血糖浓度持续24周高于16.7 mmol·L-1作为造模成功的标准； TO901317组大鼠在造模后第25周时一次性双眼玻璃体内注射5 μL TO901317(3.125 g·L-1)，正常组、模型组大鼠此阶段不做任何处理。

1.2.2 空腹血糖浓度检测各组大鼠造模前和造模结束时，均于禁食24 h后采集尾静脉血，以罗氏血糖仪检测空腹血糖浓度，并记录数据。

1.2.3 视网膜标本制备造模结束并检测空腹血糖浓度后以10 g·L-1水合氯醛 0.6 g·kg-1腹腔内注射过量麻醉处死各组大鼠，迅速摘取双侧眼球于动物手术显微镜下在冰面上迅速钝性分离视网膜，一侧眼球的视网膜浸入4 g·L-1多聚甲醛固定液中固定24 h，按照常规步骤脱水、透明、浸蜡和包埋，用于HE染色；另一侧眼球放置于液氮中保存，用于ELISA、实时荧光定量PCR和Western blot实验。

1.2.4 HE染色制作平行于视神经的连续矢状眼球切片，片厚4 μm，摊片、烤片后用二甲苯和梯度乙醇常规脱蜡至水，苏木精初染2 min，用体积分数0.1%盐酸乙醇分化5 s，1 g·L-1氨水返蓝5 s，0.5 g·L-1伊红液复染4 min，脱水、透明后用中性树胶封片。显微镜下观察各组大鼠视网膜形态结构和微血管变化情况，测量各组大鼠视网膜厚度。

1.2.5 ELISA法检测大鼠视网膜IL-1β、IL-6含量取出部分液氮内冻存的视网膜组织，严格按照IL-1β、IL-6 ELISA检测试剂盒操作步骤检测各组大鼠视网膜组织内IL-1β、IL-6含量。

1.2.6 实时荧光定量PCR检测大鼠视网膜ABCA1、IL-1β、IL-6、VEGF的mRNA相对表达量取适量大鼠视网膜组织冰上剪碎研磨后，利用RNeasy Mini Kit 试剂盒提取各组大鼠视网膜组织总RNA，检测合格后经反转录生成cDNA，按相应试剂盒说明书步骤扩增ABCA1、IL-1β、IL-6、VEGF的mRNA，选取β-actin为内参，具体引物序列见表1。每组设置3个复孔，按照95 ℃ 30 s(预变性)，95 ℃ 10 s(变性)，60 ℃ 20 s(退火)，75 ℃ 20 s(延伸)进行40个循环，以β-actin基因为内参，以2-△△Ct法计算ABCA1、IL-1β、IL-6、VEGF mRNA的相对表达量。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

1.2.7 Western blot检测大鼠视网膜ABCA1、VEGF、IL-1β、IL-6蛋白表达水平取各组大鼠视网膜组织，用生理盐水清洗后于EP管内在冰上将组织剪碎，加入蛋白裂解液进行组织裂解，提取蛋白后用BCA法检测各组大鼠视网膜组织蛋白浓度。取20 μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后将蛋白转移至PVDF膜上，5 g·L-1脱脂奶粉室温封闭4 h，分别加入稀释的目的蛋白ABCA1、IL-1β、IL-6、VEGF和内参β-actin一抗(11000)，置于4 ℃摇床上孵育过夜后加入相应二抗(15000)，用TBST洗膜3次，每次10 min，随后置于暗室内发光、压片、曝光、显影、定影，采集图像，用ImageJ 1.8.0分析各组蛋白条带灰度值，利用内参进行蛋白定量。

1.3 统计学分析采用SPSS 26.0 统计学软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 各组大鼠造模前后空腹血糖浓度造模前各组大鼠空腹血糖浓度比较，差异均无统计学意义(均为P>0.05)；造模后模型组和TO901317组大鼠空腹血糖浓度均较各自造模前和正常组造模后明显升高，差异均有统计学意义(均为P<0.05)(见表2)。

表2 各组大鼠造模前后空腹血糖浓度

2.2 各组大鼠视网膜组织形态及厚度变化正常组大鼠视网膜各层组织间连接紧密，细胞排列整齐，各细胞形态及微血管结构正常。模型组和TO901317组大鼠视网膜可见内界膜肿胀断裂严重，部分内皮细胞突出内界膜，视网膜神经节细胞层细胞减少明显，微血管结构遭到破坏，内丛状层、内核层、外丛状层、外核层细胞数量也减少，排列稀疏；两组大鼠视网膜厚度均较正常组明显增加，差异均有统计学意义(均为P<0.05)；TO901317组大鼠视网膜各层结构改变介于正常组与模型组之间，视网膜厚度较模型组明显变薄，差异有统计学意义(P<0.05)(见图1和表3)。

图1 各组大鼠视网膜组织切片HE染色结果 GCL：神经节细胞层；IPL：内丛状层；INL：内核层；OPL：外丛状层；ONL：外核层。

表3 各组大鼠视网膜厚度和视网膜IL-1β、IL-6的含量

2.3 各组大鼠视网膜IL-1β、IL-6含量与正常组相比，模型组大鼠视网膜IL-1β和IL-6含量均明显升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05)；TO901317组大鼠视网膜IL-1β和IL-6含量较模型组均明显下降，差异均有统计学意义(均为P<0.05)(见表3)。

2.4 各组大鼠视网膜ABCA1、IL-1β、IL-6、VEGF的mRNA相对表达量模型组大鼠视网膜ABCA1的mRNA相对表达量较正常组和TO901317组均显著降低，差异均有统计学意义(均为P<0.05)；模型组大鼠视网膜IL-1β、IL-6、VEGF的mRNA相对表达量较正常组和TO901317组均显著升高，差异均有统计学意义(均为P<0.05)(见表4)。

表4 各组大鼠视网膜ABCA1、IL-1β、IL-6、VEGF的mRNA相对表达量

2.5 各组大鼠视网膜ABCA1、VEGF、IL-1β、IL-6蛋白相对表达量模型组大鼠视网膜ABCA1蛋白相对表达量均较正常组和TO901317组显著降低，差异均有统计学意义(均为P<0.05)；模型组大鼠视网膜IL-1β、IL-6和VEGF蛋白相对表达量均较正常组和TO901317组显著升高，差异均有统计学意义(均为P<0.05)(见图2和表5)。

图2 各组大鼠视网膜ABCA1、VEGF、IL-1β、IL-6蛋白表达情况

表5 各组大鼠视网膜ABCA1、VEGF、IL-1β、IL-6蛋白相对表达量

3 讨论

DR是糖尿病的重要并发症之一，主要损伤视网膜的结构和功能，造成患者视力损害甚至丧失，严重影响中老年糖尿病患者的健康和生活。DR主要与视网膜脂质代谢异常、炎症反应和微血管病变有关[14-16]。DR发生发展过程中视网膜长期处于慢性炎症状态，炎症因子表达升高，以IL-1β和IL-6升高最为突出[17-18]。视网膜炎症一方面造成视网膜水肿，视网膜各层结构与细胞肿胀，排列疏松；另一方面长期炎症反应使视网膜血管壁结构与通透性遭到破坏，产生微血管瘤，造成视网膜供血不足，组织缺血缺氧，进一步加重了炎症反应和视网膜损伤。受损的视网膜血管引发代偿性新生血管形成，但视网膜新生血管无正常的血管功能及结构，易发生破裂出血，出血部位易发生机化进而造成视网膜裂孔和脱离，造成患者视力减退甚至丧失[19-20]。VEGF在促进细胞增殖和新生血管形成中发挥重要作用[21-22]。研究证明，DR患者视网膜新生血管的严重程度与眼内VEGF的水平密切相关，玻璃体内注射抗VEGF药物(雷珠单抗、康柏西普)可以下调视网膜VEGF表达，抑制视网膜新生血管形成[23]，抗VEGF已成为目前眼科临床治疗DR的一线方法。但因其价格昂贵，患者经济负担较大，寻找新的可以抑制DR患者视网膜炎症且抗新生血管形成的药物仍迫在眉睫。

肝X受体是一种核受体，在人类和小鼠视网膜上均有表达[24]。肝X受体通过激活并上调ABCA1的表达进而下调核因子κB的表达，在一定程度上可抑制炎症反应，同时激活的ABCA1在ATP作为能量供体的情况下，可促进细胞内胆固醇、游离磷脂的排出，从而发挥抗炎作用。当ABCA1转运发生障碍时可导致细胞内胆固醇聚集形成泡沫细胞，入侵血管壁后也会促进血管硬化[25]。已有研究证实，非特异性肝X受体激动剂TO901317可以激活ABCA1，下调葡萄膜炎小鼠视网膜炎症因子的表达，从而起到抗炎和保护视神经的作用[26]。

本研究通过一次性腹腔注射链脲佐菌素的方法制备大鼠DR模型，注射后24周检测大鼠空腹血糖浓度发现，模型组大鼠血糖浓度明显升高，达到糖尿病造模水平。通过HE染色发现,模型组大鼠视网膜组织结构肿胀、细胞排列疏松、视网膜厚度明显增加、微血管结构受损，证明DR大鼠模型制备成功。通过检测发现，模型组大鼠视网膜IL-1β、IL-6含量明显升高， IL-1β、IL-6在mRNA和蛋白水平上表达均升高，说明DR大鼠视网膜发生炎症反应，炎症因子表达升高，炎症反应一定程度上导致视网膜组织肿胀，细胞排列疏松。本研究还发现，模型组大鼠视网膜ABCA1 mRNA和蛋白表达较正常组均明显降低，VEGF mRNA和蛋白表达较正常组均明显升高，结合HE染色结果，说明炎症反应、ABCA1表达下降和VEGF表达升高可导致视网膜血管壁结构异常，通透性增加，同时也促进了新生血管形成。

本研究还发现，在DR大鼠模型制备成功后给予3.125 g·L-1肝X受体激动剂TO901317玻璃体内注射后，大鼠视网膜各层组织肿胀、细胞排列疏松等视网膜损伤表现较模型组得到一定缓解，视网膜厚度也有所降低；进一步检测发现，视网膜IL-1β、IL-6含量较模型组下降，视网膜ABCA1 mRNA和蛋白表达较模型组均明显升高，IL-1β、IL-6和VEGF mRNA和蛋白表达均较模型组明显降低。这些结果说明，玻璃体内注射TO901317可以上调ABCA1表达，在一定程度上抑制DR大鼠视网膜炎症反应，降低炎症因子IL-1β、IL-6的高表达，缓解视网膜组织肿胀、厚度增加和细胞排列疏松等病理学改变，同时也可以抑制VEGF的高表达，在一定程度上降低DR大鼠视网膜血管损伤和新生血管形成。

综上所述，肝X受体激动剂TO901317可以上调ABCA1表达，下调IL-1β、IL-6和VEGF表达，抑制DR大鼠视网膜炎症反应和新生血管形成，对DR大鼠视网膜有一定保护作用。这为DR的预防和治疗提供了新的药物研究方向。