牙科综合治疗台水路系统污染微生物调查及其消毒方法

吴晓松，王 玲，吴红梅，徐宇馨，范晶晶，徐 燕，梁睿贞

(1. 江苏省疾病预防控制中心，江苏 南京 210009； 2. 国家卫生健康委员会肠道病原微生物重点实验室，江苏 南京 210009； 3. 南京医科大学附属口腔医院护理部，江苏 南京 210029； 4. 江苏省口腔疾病重点实验室，江苏 南京 210029； 5. 南京医科大学附属口腔医院口腔内科教研室，江苏 南京 210029)

牙科综合治疗台使用水来冷却高速旋转的牙科手机和冲洗牙齿表面，并在牙科治疗期间为患者提供漱口水。互连的牙科综合治疗台水路系统(dental unit waterlines, DUWLs)组成的复杂网络向这些器械供水。由于牙科手机在停转瞬间的“回吸效应”和来自公共供水系统中定植的微生物，DUWLs普遍存在严重的微生物污染，是牙科交叉感染的重要危险因素，曾有患者因于牙科就诊感染水路中的军团菌而死亡[1]，DUWLs中的微生物也可能对老年人与免疫缺陷的患者造成严重威胁[2]。

DUWLs中微生物种类繁多，存在形式以生物膜和浮游菌两种为主，研究[3]表明，铜绿假单胞菌、嗜肺军团菌、大肠埃希菌、阿米巴原虫、真菌、分枝杆菌等都可以在DUWLs被发现。虽然大部分是条件致病菌，但由于牙科诊疗操作存在血液、唾液和气溶胶传播的风险，因此，如何控制DUWLs中的微生物，成为牙科诊疗消毒和感染控制的重点。

化学消毒法是目前对DUWLs微生物污染进行消毒与感染控制的主要方法，有报道[4]采用低浓度的化学消毒剂如含氯消毒剂(如次氯酸钠)、醋酸氯己定等周期性或持续性对DUWLs进行消毒处理，可以有效杀灭DUWLs中的浮游菌，去除生物膜。但在水路中长期使用低浓度的消毒剂对DUWLs会有何影响，是否会导致细菌对消毒剂的敏感性下降，甚至诱导细菌产生抗性而导致消毒失败尚缺乏相关研究。本研究对定期消毒的DUWLs进行污染微生物种类分析，通过最低抑/杀菌浓度和消毒剂杀灭效果等试验观测分离优势菌对常用水路消毒剂的抗性，为临床规范和安全使用水路消毒剂提供数据支持，为进一步加强牙科消毒与感染控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 标本与材料 试验对象为江苏省某三级甲等口腔专科医院综合科使用中牙科综合治疗台。污染微生物标本来自该院综合科24台同品牌同使用年限的牙科综合治疗台(2011年购置)，该批次牙科综合治疗台消毒频次为每2周一次，消毒剂为含氯消毒剂，使用浓度为有效氯500 mg/L。

标准菌株为龟分枝杆菌脓肿亚种 ATCC 93326(军事医学科学院，北京)。

1.2 仪器与试剂 飞行质谱鉴定仪(VITEK Mass Spectrometry)购自法国梅里埃公司，恒温水浴箱购自美国PolyScience公司，恒温培养箱购自德国Incucell MMM，微生物集菌仪(HTY-601)购自杭州泰林生物技术设备有限公司。

醋酸氯己定(AR)为德国SIGMA公司产品，84消毒剂为江苏爱特福股份有限公司产品，过氧乙酸消毒剂为南京化学试剂股份有限公司产品，过氧化氢消毒剂为南京化学试剂股份有限公司产品，牛血清白蛋白(BSA)为美国AMRESCO公司产品，营养肉汤培养基和营养琼脂培养基及相关试剂均为国内市售产品。

1.3 试验方法

1.3.1 标本采集 于试验当日开诊前半小时采集24台牙科综合治疗台高速手机出水口处的水10 mL，连续采集2份标本，采集前先踩手机脚踏控制板，空转30 s冲洗水管后进行采样，同时取该牙科综合治疗台对应的自来水10 mL作为阴性对照组。

1.3.2 细菌计数及鉴定 将出水口每个标本各取1.0 mL、100 μL分别涂布普通营养琼脂平板和铜绿假单胞菌选择性平板，35℃培养48 h，进行细菌计数和铜绿假单胞菌选择性培养，同时对普通营养琼脂平板上的菌落挑取单个菌落进行四区划线并纯化，剩余标本使用微生物集菌仪进行贴膜培养，并挑取单个菌落进行四区划线并纯化。阴性对照组采用同样方法进行试验。挑取平皿四区中的典型菌落，均匀涂在靶板的定位孔内，再加1 μL基质液，以16孔为一个区域，在中心孔涂布标准菌株。输入靶板号，进入飞行质谱鉴定系统进行鉴定。

1.3.3 病原菌对消毒剂抗力测定 将DUWLs分离的优势菌产黏液分枝杆菌与标准菌株龟分枝杆菌脓肿亚种分别接种Middlebrook 7H10琼脂斜面，取37℃培养48 h新鲜培养物，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗下菌苔并稀释配制成菌悬液备用。采用肉汤稀释法，测定各试验菌对消毒剂最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)和最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration, MBC)，MIC和MBC试验均重复3次。

1.3.4 悬液定量杀菌试验 在20℃试验条件下将含3%牛血清白蛋白的菌悬液与消毒剂混合作用一定时间，取混合液至中和剂中，中和作用10 min，取0.1 mL涂布营养琼脂平板，进行活菌计数，同时用TPS稀释液代替消毒剂进行平行试验，作为阳性对照。计算杀灭对数值，试验重复3次。

2 结果

2.1 DUWLs中的细菌含量和微生物检测结果 24台DUWLs的48个标本菌落检出率100.00%，平均菌落数(2.25±1.43)×105CFU/mL，对照组24个自来水标本平均菌落数为(38.21±1.86)CFU/mL，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。经鉴定，24台DUWLs中共检出9种污染微生物，其中产黏液分枝杆菌占比(35.72%)最高，未检出铜绿假单胞菌和军团菌。见表1。

表1 24台DUWLs检出微生物及分布

2.2 优势菌对常见消毒剂抗力测定结果 经鉴定试验证明，采用5 g/L硫代硫酸钠+20 g/L吐温80+3 g/L卵磷脂肉汤能有效中和醋酸氯己定残留毒性；5 g/L硫代硫酸钠+5 g/L吐温80肉汤能有效中和次氯酸钠、过氧乙酸、过氧化氢三种消毒剂的残留毒性。醋酸氯己定、次氯酸钠、过氧乙酸、过氧化氢对10株优势菌产黏液分枝杆菌的MIC均分别为1.5、500、5、100 mg/L，4种消毒剂对标准菌株的MIC分别为6、700、25、1 000 mg/L；4种消毒剂对10株优势菌产黏液分枝杆菌的MBC均分别为3、500、10、200 mg/L，4种消毒剂对标准菌株的MBC分别为600、700、50、1 000 mg/L。4种常用消毒剂对优势菌的MIC和MBC均低于标准菌株龟分枝杆菌脓肿亚种ATCC 93326。

2.3 不同消毒剂在不同作用时间对优势菌的杀灭效果 由于分离的10株产黏液分枝杆菌对4种消毒剂的MIC与MBC一致，选择1号菌株进一步进行不同消毒剂对其的杀灭效果试验。结果显示：0.5%醋酸氯己定在作用30 min时对试验菌株和标准菌株的平均杀灭对数值均<4.00，未达到消毒要求；0.1%次氯酸钠作用10 min，对分离优势菌的杀灭对数值>4.00，作用20 min对标准菌株龟分枝杆菌脓肿亚种的杀灭对数值>4.00，达到消毒要求； 0.1%过氧乙酸作用10 min，对分离优势菌和标准菌株龟分枝杆菌脓肿亚种的杀灭对数值均>4.00，达到消毒要求；3%过氧化氢作用30 min，对分离优势菌和标准菌株龟分枝杆菌脓肿亚种的杀灭对数值均>4.00，达到消毒要求。见表2。

表2 4种常用消毒剂对试验菌株及标准菌株不同作用时间的杀灭对数值

3 讨论

本研究发现，该医院DUWLs被大量的微生物污染，数量级达到105，细菌来自水路中浮游菌和生物膜，与以往的研究[5]相近。通过质谱分析仪进一步分析菌群的构成，共分离9种微生物，其中产黏液分枝杆菌占比最高，达35.72%，其次为真菌，占21.43%，另有少量的艰难梭菌、螯肢分枝杆菌等，但未检出铜绿假单胞菌和军团菌。此结果与Barbeau等[6]报道DUWLs中铜绿假单胞菌的检出率达24%存在差异，也使本研究利用铜绿假单胞菌筛选培养基对其主动收集的研究设计未能得以体现，但与鲍容等[7]对医院供水系统分枝杆菌污染的调查结果相近。分析其原因为水路系统中细菌繁多，生态复杂，不同医院不同科室的DUWLs中可能存有不同的细菌生态；其次更可能的原因是饮用水系统经氯化处理后系统内的菌落发生变化，非致病性分枝杆菌和鞘氨醇属为菌落中的优势菌[8]，不同水源、不同条件下供水系统生物膜内菌落的研究中，均检测到分枝杆菌，某些情况下分枝杆菌为其主要菌落[9-11]。而该口腔医院一直使用含氯消毒剂对DUWLs进行定期消毒，由此可见，对DUWLs的消毒处置特别是使用含氯消毒剂可能是本研究中产黏液分枝杆菌成为优势菌的原因之一。

产黏液分枝杆菌属于非结核分枝杆菌(Nontuberculosis mycobacteria， NTM)中的快速生长分枝杆菌，可通过呼吸道、胃肠道、皮肤黏膜等途径侵入人体，作为一种条件致病菌，通常情况下可在人体中保持平衡，多在机体抵抗力下降时发病，可导致淋巴结炎、慢性肺部疾病、创伤后皮肤感染和败血症等，与医院感染密切相关[12]。近年来NTM的检出率及其感染发病率不断增高，有研究[13]报道南京地区NTM检出率为15.5%，感染发病率为56.5%。墨西哥一所创伤医院的饮用水标本中NTM检出率为52%，其中产黏液分枝杆菌占81%[14]，另有研究[15]报道产黏液分枝杆菌通过医院供水系统，在患者淋浴时污染中央静脉导管，导致患者菌血症的暴发。本研究中的口腔诊疗多为有创操作，常需直接接触患者的血液、唾液和口腔黏膜等，同时高速手机在运转时又需要不断的供水冷却，DUWLs的污染可导致交叉感染，因此，对DUWLs中分枝杆菌的高检出率应高度重视。

细菌对消毒剂的抗性是指出现对常用浓度的消毒剂不再敏感的菌株，普遍认为广泛或不合理使用消毒剂可产生筛选压力[16]，若长期使用亚致死浓度的消毒剂，则易导致细菌对该浓度的消毒剂产生适应效应，最终演变为对消毒剂的抵抗[17]。临床流行的分枝杆菌对2%醋酸氯己定具有高度抗性[18]，本研究中虽然在MIC、MBC中未观察到产黏液分枝杆菌对醋酸氯己定的抗性超过标准菌株，但在悬液定量杀菌试验中，30 min内常用浓度的醋酸氯己定并不能有效杀灭产黏液分枝杆菌，提示无论是在DUWLs中使用醋酸氯己定进行消毒还是通过含漱液(含醋酸氯己定)预防控制患者口腔感染，都存在感染风险。另外通过对口腔诊疗中现行DUWLs消毒与感染控制措施的初步研究发现，水路中分离的产黏液分枝杆菌对高效消毒剂(含氯消毒剂、过氧化氢、过氧乙酸)的抗力也有部分发生变化，其对次氯酸钠的MIC及MBC值均较高，接近标准菌株的抗力水平，提示使用的化学消毒法，已对本研究所选医院DUWLs的污染微生物菌群产生影响，对含氯消毒剂抗力更强的NTM已取代铜绿假单胞菌与军团菌成为优势菌群，因此在对本研究所选医院DUWLs进行化学消毒时应特别注意消毒剂种类的选择，浓度、频率及操作的规范化。

本研究仅对一所三级口腔专科医院进行研究，数据覆盖面较小，在DUWLs中NTM是否因为消毒方式的选择而广泛取代铜绿假单胞菌等传统优势菌群还需要进一步研究。