基于靶向代谢组学检测探讨瀑布森林环境疗养 对亚健康患者脂肪酸水平的变化情况

朱紫馨 欧阳秋月 赵雪珂 程明亮 罗新华 (1.贵州医科大学病理生理学教研室；.贵州医科大学附属医院感染科；3.贵州省人民医院感染科)

亚健康是指人体处于健康和疾病之间的一种状态[1]。现代医学对此病的治疗主要采用营养支持、心理治疗等，但大多为对症治疗，确能缓解其中一部分的临床症状，但长期疗效并不理想，且消耗着大量的医疗资源[2-5]。随着对环境和健康问题认识水平的深化 ,医学地理学得到蓬勃发展。越来越多的研究证实自然环境可促进人体健康，形成了自然康养的雏形。研究表明大型瀑布周边的高负氧离子环境对皮肤过敏或哮喘等呼吸系统疾病患者有辅助治疗的功效[6-7]。目前对于天然瀑布森林环境对亚健康人群的改善作用，尤其在脂肪酸方面，国内研究甚少。本次实验运用质谱技术代谢组学这一手段，研究亚健康受试者处于天然瀑布森林环境对机体脂肪酸代谢物的变化水平。以期对瀑布森林环境对于人体健康的机制进行更深入的揭示。报告如下。

1 资料与方法

1.1实验地点及时间 本研究在中国贵州省安顺市黄果树瀑布核心景区进行。黄果树大瀑布坐落于东经105°40′,北纬25°59.5′。平均海拔约950 m，常年平均温度15.6℃，温度最高的7月份平均温度23.2℃，温度最低的1月份平均温度5.9℃。年平均降水量为1 307 mm。全年相对湿度为80%左右，日照率30%。大瀑布附近负氧离子含量达每立方米2 000个以上，比一般地区高出10倍左右。瀑布周围植被茂密，苔藓地衣丰富，为理想的实验地点。根据气候及环境特点6月到9月的这段时间显示出最高水平的空气中负氧离子含量。为了使人群在自然环境干预效果最大化，本次实验选择在8月份进行。本次实验经过贵州省人民医院伦理委员会批准，通过网络及海报广告招募方式筛选出符合本次实验研究标准的32名20至55岁的亚健康人群。后经课题组严格筛选出12名符合调查选择标准并自愿同意参与研究的受试者纳入研究。亚健康疲劳属于生理性疲劳和病理性疲劳之间的中间状态，因此确定亚健康疲劳，一方面要排除生理性疲劳(休息后容易恢复的特点，即短期的疲劳)，另一方面还要排除器质性疾病、精神性疾病(如抑郁症)等有关疾病。在专业心理科医生的辅助帮助下对受试者的感知力及心理变化描能力进行入组前评估。纳入标准：①20～50岁 每日城市环境中等及以上强度劳动工作者，居住地为城市地区男女不限;②BMI指数：19～25之间;③近期(6个月及以上)出现精神倦怠、抑郁、失眠健忘、睡眠质量下降、注意力降低等情况;④伴或不伴有伴颈部、腋窝淋巴结轻度肿痛，但体检和常规实验室检查未发现明显异常。排除标准：①准备妊娠或孕期、哺乳期妇女;②排除精神疾病、甲状腺功能减退症、糖尿病等相关心血管、消化、内分泌、神经等方面疾病，需长期服药及定期复诊的患者。;③近期(6个月内)进行过麻醉手术的患者。中途退出标准:①受试者不能适应环境变化，出现睡眠质量显著下降、食欲欠佳，且迫切想通过退出实验进行改善。②受试者在实验过程中出现严重急性病变(呼吸系统感染、消化系统炎症)需用药治疗，或需住院治疗的外伤等病变。主要试剂和仪器为：正己烷(国药 优级纯) ；正十九酸甲酯(TCI>99.0%)；甲醇(国药 HPLC) ；Agilent 7890/5975C 气-质联用仪(安捷伦,美国) ；Electronic Balance (WT3003N) ；涡旋仪(QL-866) ；冷冻离心机(湘仪,H1650-W) ；电热恒温水浴锅(长安科学仪器) ；色谱柱Agilent DB-WAX 毛细管柱30 m×0.25 mm ID×0.25um 。

1.2方法 本次实验时间选择为8月19日-25日，总计7 d，景区为夏季丰水期，水流量50 m2/s，平均气温23℃。前往贵州省安顺市黄果树风景区进行瀑布森林环境综合干预。并将实验目的和程序充分告知所有受试者。受试者的控制变量如下:(1)参与实验前24 h及整个实验过程中限制饮酒及吸烟;(2)每次实验抽血前8 h内限制食物摄入;(3)未实施过包含其他自然环境的治疗方案;(4)限制在试验区域以外的过度活动;(6)限制过度使用电子移动设备(大于8h/日)或熬夜等不良生活作息;(7)在整个实验参与期间提供规律饮食在此基础上所有受试者前往黄果树瀑布景区进行自然环境干预。期间入住黄果树核心景区附近(500 m)酒店住宿,海拔为1 024 m，为了尽量避免饮食变化对于脂肪酸的改变情况。在整个实验期间一日三餐统一酒店托管安排，确保每日统一菜品制作用油，并由营养医师提供每日均衡食谱。活动强度为中等活动强度，并确保受试者每日在瀑布气溶胶环境内活动时间为8 h。实验开始前1 日(A组)和实验第3日(B组)，第7日(C组)抽取所有受试者肘静脉血10.0 mL，以3 000×g离心15 min，取上清，进行试验。

1.2.1标准品配制 采用40种脂肪酸甲酯混合标准品溶液制成0.5 mg/L,1 mg/L,5 mg/L,10 mg/L,25 mg/L,50 mg/L,100 mg/L,250 mg/L,500 mg/L,1 000 mg/L10个混合标准浓度梯度,其中浓度为各组分的总浓度。40个脂肪酸甲酯的标准品中,各组分浓度占总浓度的比例有2%,4%两个梯度,其中,30种组分占2%,10种组分占4%。取500 μL混合标准品,加入25 μL浓度为500 ppm的正十九酸甲酯作为内标,混匀加入进样瓶,进入GC-MS 检测,进样量 1 μ L,分流比 10:1,分流进样。

1.2.2代谢物提取 将样品冰上解冻,取200ul样品于2 mL玻璃离心管中。加入1 mL的氯仿甲醇溶液,超声30 min,取上清液,加入1%的硫酸-甲醇溶液2 mL,放在80℃水浴上,甲酯化半小时,再加1 mL的正己烷萃取,加5 mL的纯水洗涤,吸取上清液500 μL,加入25 μL加入25 μL的水杨酸甲酯作为内标,混匀加入进样瓶,进入GC-MS 检测,进样量1 μ L,分流比10:1,分流进样。

1.2.3色谱-质谱分析 (1)气相色谱条件：样品采用Agilent DB-WAX 毛细管柱(30 m×0.25 mm ID×0.25 μm)气相色谱系统进行分离。程序升温:初始温度50℃;保持3 min,以10℃/min升温至220℃;并维持5 min。载气为氦气,载气流速 1.0 mL/min。(2)质谱分析:采用Agilent 7890/5975C 气-质联用仪进行质谱分析。进样口温度 280℃;离子源温度230℃;传输线温度 250℃。电子轰击电离(EI)源,SIM 扫描方式,电子能量 70eV。

1.2.4数据处理 采用MSD ChemStation软件提取色谱峰面积及保留时间。绘制标曲曲线,计算样品中中长链脂肪酸的含量。

1.2.5质谱数据处理 原始数据经ProteoWizard转换成.mzXML格式,然后采用XCMS程序进行峰对齐、保留时间校正和提取峰面积。代谢物结构鉴定采用精确质量数匹配(<25 ppm)和二级谱图匹配的方式,检索实验室自建数据库。

2 结 果

2.1受试者人口学特征和血生化结果 统计亚健康人群年龄、身高、体重等情况。见表1。

表1 受试人员人口学特征表

2.2不同干预时间受试者AST、ALT及TG、TBA的影响 机体中脂肪酸的调节常常受肝脏状态的影响。总胆汁酸(total bile acid，TBA)是胆固醇在肝脏分解及肠-肝循环中的一组代谢产物，是胆固醇在肝脏分解代谢的最终产物，与胆固醇的吸收、代谢及调节关系密切。肝脏则为合成甘油三酯(TG)的场所。ALT、AST是目前临床诊断肝损伤的常用血清生化指标, 本实验通过生化指标评价瀑布森林环境不同干预时间对于血液中脂肪酸含量的影响。从减压结果可知，瀑布森林环境随着时间的延长AST、ALT及TG、TBA数值均呈现下降趋势，但未见统计学差异。

2.3主成分分析(PCA) 以脂肪酸量为 X 变量，共A、B、C组共 24个样本，采用XCMS软件对代谢物离子峰进行提取。将所有实验样本和QC样本提取得到的峰,经Pareto-scaling得到的PCA模型,如下图代表所示正模式下，瀑布森林环境干预前(A组)较干预后B、C组分开，PCA 分析结果表明瀑布森林环境前后血清脂肪酸代谢轮廓差异明显。

2.4差异代谢物结果 抽取受试者环境干预前(A组)，环境干预第3 d(B组)，环境干预第7 d(C组)的血液进行GC-MS中长链脂肪酸代谢分析。不同干预时间点，差异物有所不同。瀑布森林环境干预3 d后，油酸、肉豆蔻酸、棕榈酸等含量下降(P<0.05)。7 d后出现癸酸、十一烷酸等脂肪酸含量下降，且具有统计学意义。

表2 A组与B组比较差异代谢物

表3 A组与C组比较差异代谢物

2.5KEGG代谢通路分析 将三组不同时间点的瀑布森林环境比较分析得到的全部差异代谢物提交到 KEGG 网站，进行相关通路分析。结果显示，所有差异性代谢物共参与81条代谢通路，其中3种及以上差异性代谢物同时参与的代谢通路共 13条。下图为相关性最大的信号通路气泡图。提示天然高负氧离子瀑布森林环境可能参与了胆碱、氨基酸代谢，HIF-1信号通路等信号通路的转导。

3 讨 论

现代城市化进程加快，人类亚健康及心理疾病患病率逐步上升。运用瀑布森林环境作为一种宝贵的自然资源，这一非临床的环境理疗方式也逐步得到重视。 Carina Grafetstätter 等研究表明瀑布小气候的暴露疗法对儿童哮喘具有良好的辅助治疗效果[8-10]。大型瀑布及其附近辐射环境因落差较大，水分子裂解充分的原因，负氧离子含量常持续在较高浓度。单纯森林环境则受到昼夜节律及温度的影响较大。瀑布森林综合环境中，靠近水源地带，环境优越，植物多样性 更加丰富，使得芳香类物质等植物杀菌素在水雾环境中播散更广泛，粘附皮肤及粘膜时间持续，更加有利于健康屏障的建立。

本次实验运用GC-MS质谱分析瀑布森林环境对于亚健康受试者脂肪酸代谢的调节机制。血生化结果表明瀑布森林环境可下调转氨酶水平，虽未见统计学差异，但笔者推测其对于肝脏微炎症环境有改善作用。而油酸、棕榈酸、棕榈油酸等在瀑布森林环境干预后出现下降趋势。彭克楠等研究表明，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)患者肉豆蔻酸、棕榈酸等水平较健康受试者升高[11]。因此本次实验结果提示，经过瀑布森林环境康养干预受试者有降低患脂肪肝的可能，可能为一个潜在的辅助治疗手段。其机制主要在于对饱和脂肪酸的调控。笔者猜测亚健康人群因环境作息等综合因素导致机体处于微炎症、免疫力降低的状态。瀑布森林环境干预后，机体抗氧化活性增强，细胞内膜系统上脂肪酸脂质氧化作用增强，提示三羧酸循环受到触发，故血液中脂肪酸水平降低。值得注意的是，瀑布森林环境干预第7 d后，油酸等水平出现小范围升高，笔者猜测这与肝脏肝糖原储备完成，机体氧化水平稳定，肝细胞损伤修复，肝脏糖原储备已修复相关。这可能与KEGG聚类分析中m TOR通路调控发挥作用相关。PI3K/Akt/m TOR是细胞内非常重要的信号转导途径。在细胞的生长、增殖、分化及蛋白合成的过程中发挥着重要作用。m TOR上游的磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)属于细胞内磷脂酰肌醇激酶的一种，同时具备丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和磷脂酰肌醇激酶的活性，PI3K激活后，可以把细胞膜上的磷脂酰肌醇家族成员磷酸化，募集和激活下游信号分子蛋白激酶 B(Akt)，Akt被PI3K激活后可以通过磷酸化一系列底物，如mTOR，NF-kB等来影响细胞的增殖、分化及凋亡、代谢、血管生成等。同时可调控肿瘤细胞的自噬水平，与KEGG富集中的胆碱代谢、帕金森通路等进一步产生关联。有研究表明，空气中污染颗粒增加会使得肝糖原储存受损、葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗。因此天然瀑布森林环境有可能增强肝脏对肝糖原储备受损的修复能力。但具体干预时间节点，和具体调控的基因靶点和蛋白表达影响仍需要进一步探究。本研究从脂肪酸代谢的层面上初步探索了瀑布森林环境对亚健康人群脂肪酸水平的影响,为深入研究环境对肝脏代谢的影响奠定基础。

致谢：感谢贵州省气象局生态气象与卫星遥感中心和贵州省安顺市黄果树旅游区教育事务管理中心。