艽龙胶囊对大鼠急性胃溃疡的保护作用及机制研究

陈贵娥 唐天乐 唐源 董明芝 刘铁明 梅其炳 孙阳△

(1.中国人民解放军南部战区海军第一医院药剂科，广东 湛江 524005；2.空军军医大学药理教研室， 国家中药胃肠药理重点实验室,陕西 西安 710032；3.西安正大制药有限公司，陕西 西安 710032)

胃溃疡是消化性溃疡中最常见的类型，胃黏膜上皮的完整性、黏膜细胞更新、表皮生长因子、黏液-碳酸氧盐屏障、黏膜血流、前列腺素等因素构成了黏膜的防御屏障[1-3]。幽门螺杆菌感染、应激、药物等是导致溃疡的攻击因子与保护胃黏膜的防御因子失衡的主要因素，是胃溃疡发生的主要原因[4-8]。中医药在防治胃溃疡方面具有独特优势，艽龙胶囊是首个从天然植物秦艽中提取出来的以龙胆苦苷为主要成份的纯中药制剂。本品具有清肝泻热之功效，用于治疗功能性消化不良属肝胃郁热证者，症见胃脘饱胀，脘部烧灼，口干口苦等。本研究通过建立无水乙醇诱发大鼠急性胃溃疡模型，探讨艽龙胶囊对胃溃疡的预防作用，为该产品的临床应用与深入研究提供实验依据。报告如下。

1 材料与方法

1.1实验材料 阿司匹林，厂家：沈阳奥吉娜药业有限公司，货号：170602。分析纯酒精(安徽安特食品股份有限公司，批号：1610073301 )； 试剂盒： MPO试剂盒，南京建成生物工程研究所，规格：100管/48样，批号：20171007；SOD试剂盒，南京建成生物工程研究所，规格：100管/96样，批号：20171026。肝糖原试剂盒，南京金益柏生物科技有限公司，规格：100管/48样，批号：JEB-13992。仪器设备：电子天平(ME204，METTLER公司)；光学显微镜(Nikon H600L，日本Nikon公司)；高速冷冻离心机(Eppendorf 5418R，德国Eppendorf公司)；实验病理系统(HM34E，德国Ieiss公司)；酶标仪(Imark，美国伯乐)。实验动物：SD大鼠，雌雄各半，体重200～225 g。购于空军军医大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK(军)2012-0007。单笼饲养于屏障系统内，湿度40%～50%，温度(22±2℃)。颗粒饲料 (空军军医大学实验动物中心提供) 喂养，自由饮水，实验前适应性饲养5天，造模实验前1小时禁食。

1.2实验方法 (1)动物分组及实验性大鼠急性胃溃疡模型的复制：分组：SD大鼠60只，适应环境饲养3d，按照随机数字表法分为6组，每组10只，即空白对照组、模型对照组、雷尼替丁对照组、艽龙胶囊高、中、低3个剂量组。模型复制：采用乙醇 + 阿司匹林法，复制大鼠胃溃疡模型[9,10,11]。给药前禁食不禁水12 h，首日给药前先灌胃无水乙醇1 ml/200g，1h后再灌胃阿司匹林200 mg/kg，此后每日1 次，连续给药4 d，复制胃溃疡模型。(2)给药治疗:剂量设置依据：艽龙胶囊的临床剂量为每次2粒，1日3次，规格为0.08g/粒，故60 kg成人为0.48g/日，约8 mg/kg，折算到大鼠剂量约为50 mg/kg，作为中剂量，设高剂量100 mg/kg，低剂量为25 mg/kg。给药：从实验第1天开始，空白对照

组和模型对照组给予蒸馏水，10 mL/kg灌胃，每日1次，连续7d；艽龙胶囊+模型3个剂量组分别按100 mg/kg、50 mg/kg、25 mg/kg给药，每日1次，连续7d。阳性对照药雷尼替丁(30 mg/kg)给药，每日1次，连续7d。(3)一般情况观察：动物生长状况、粪便性状、被毛色泽、自主活动、行为活动，体重每日一次。(4)溃疡面积测定：末次给药后禁食12 h，用乙醚麻醉动物，腹主动脉采血处死动物，取胃，沿胃大弯侧剪开鼠胃，用冰冷的生理盐水洗涤胃体，在冰冷的纸上黏膜向上铺平，按Guth[8]法计算：损伤长度≤1 mm( 包括糜烂点) 为1分；1 mm < 损伤≤2 mm 为2 分；2 mm < 损伤≤3 mm 为3 分；3 mm< 损伤≤4 mm 为4 分；损伤> 4 mm 为5 分；损伤宽度> 2 mm 者分值加倍，所有得分相加为溃疡指数。取溃疡及边缘部分约0.5 cm2，用10%福尔马林固定胃组织，进行病理组织学检查。其余部分刮取粘膜，液氮速冻，转入-80℃保存，待测MPO和SOD活性。

1.3统计学方法 采用SPSS13.0统计软件进行统计处理，数据用均数±标准差表示。对测定结果行单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1大鼠一般情况：正常组大鼠活泼，色泽光滑，主动饮食，饮食正常，大便湿润，呈椭圆形或条索状。实验过程中，除正常对照组以外其余各组均在造模第3d开始出现体重减轻或增长缓慢，毛发不光滑，蓬松，精神萎靡，活动减少，喜欢群集。艽龙胶囊大剂量组(100 mg/kg)对大鼠体重与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05)，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)，大鼠体重明显改善。上述结果可见，艽龙胶囊能改善酒精引起的胃溃疡大鼠一般情况，包括行为活动、体重。见表1、表2。

表1 艽龙胶囊对酒精引起的胃溃疡大鼠(雌)体重的影响

表2 艽龙胶囊对酒精引起的胃溃疡大鼠(雄)体重的影响

2.2胃粘膜溃疡指数 按Guth[3]法计算溃疡指数，图1可见，空白对照组小鼠胃粘膜呈现正常肉色，粘膜皱襞光滑，未见出血点；模型组可见弥散性出血点，胃部粘膜出现充血、水肿、出血及糜烂点；艽龙胶囊各组均可抑制溃疡形成。经胃溃疡指数分

析，结果显示，模型组大鼠胃粘膜溃疡指数明显增高；与模型组相比较，艽龙胶囊低、中、高剂量组和雷尼替丁组大鼠胃粘膜溃疡指数明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)，随着剂量的增加，其作用效果更为显著。见图1、表3。

图1 艽龙胶囊对酒精引起的大鼠胃溃疡的影响

表3 艽龙胶囊对酒精引起的大鼠胃溃疡的影响

2.3胃黏膜MPO和SOD的水平 胃粘膜MPO

和SOD水平测定结果显示，模型组大鼠粘膜组织中MPO明显升高，与正常组比较有统计学意义(P<0．01)，艽龙胶囊50、100 mg/kg剂量组胃粘膜组织中MPO水平较模型组、雷尼替丁明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)。模型组大鼠胃粘膜组织中SOD表达明显降低，与正常组比较有统计学意义(P<0．01)，艽龙胶囊50 mg/kg、100 mg/kg剂量组胃粘膜组织中SOD表达较模型组明显升高，差异有统计学意义(P<0．01)，雷尼替丁组与艽龙胶囊100 mg/kg剂量组比较，SOD表达降低，有统计学意义(P<0．05)。见表4。

表4 艽龙胶囊对酒精引起的胃溃疡大鼠胃粘膜组织MPO、SOD水平的影响

2.4病理组织学检查 胃组织做HE病理检测，正常组大鼠胃粘膜上皮完整，腺体排列规则，未见明显病理改变，无充血水肿。模型组粘膜上皮见局灶性脱落，见充血水肿，粘膜腺体萎缩，腺体呈囊状扩张，同时粘膜固有层、粘膜肌层变薄且肌层紊乱、下缘缺损。艽龙胶囊对胃溃疡大鼠胃病理损伤程度的影响，实验结果显示，艽龙胶囊大、中剂量给药组能明显减轻胃溃疡大鼠的胃黏膜损伤程度，并具有明显的量效关系。见图2。

注：A:正常组；B：模型组；C：雷尼替丁组；D：艽龙大剂量组；E：艽龙中剂量组；F：艽龙小剂量组。图2 艽龙胶囊对酒精引起的胃溃疡大鼠胃粘膜HE病理形态观察(×100)

3 讨 论

乙醇诱导的急性胃溃疡模型制备方法可靠、周期短、损伤机制明确，有利于研究药物对胃溃疡防治机制的研究[12-14]。本实验利用无水乙醇诱导大鼠胃溃疡模型结果显示：肉眼观察模型组大鼠胃黏膜可见散在出血点、条索样出血带和点状溃疡面镜下观察可见胃黏膜组织破损、不完整、伴出血和炎细胞浸润。这表明胃溃疡大鼠模型复制成功。

从中药及天然药物中寻找疗效确切、成分单一、易于观察的有效活性成分是防治胃溃疡的有效途径之一。本实验以酒精联合阿司匹林方法成功复制大鼠胃溃疡模型，表现为大鼠胃肉眼可见溃疡，粘膜组织中MPO水平的升高和SOD水平的降低，胃粘膜组织病理形态学改变。MPO是中性粒细胞产生的一种重要的过氧化物酶，其数值能够提示中性粒细胞的数目与中性粒细胞的浸润情况，也可反应炎症损伤的程度[15]。SOD，是胃粘膜的保护因子之一，能够抑制胃部的壁细胞通过氧化磷酸化产生大量ATP 和ROS，进而发挥保护胃黏膜的作用[16]。给予艽龙胶囊25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg治疗7d后，观察到：艽龙胶囊给药50 mg/kg、100 mg/kg剂量组大鼠体重较正常组大鼠体重下降无统计学差异；艽龙胶囊各剂量组大鼠胃粘膜溃疡指数较模型组比较有显著意义(P<0.01)，胃溃疡程度有明显的改善。与雷尼替丁组比较，艽龙胶囊100 mg/kg剂量组对大鼠胃溃疡程度改善无显著差异；胃粘膜组织MPO和SOD水平结果显示：艽龙胶囊使胃溃疡大鼠粘膜组织中MPO表达较模型组降低，SOD表达水平达较模型组升高； HE结果显示艽龙胶囊100 mg/kg剂量组明显改善大鼠胃粘膜组织病理形态。此外，本实验采用雌性和雄性不同性别大鼠为研究对象，是为探讨大鼠胃溃疡模型及给药治疗是否存在性别差异。我们的结果表明，雌性和雄性各组在模型复制和给药治疗效果方面均无显著差异，提示，艽龙胶囊治疗大鼠胃粘膜损伤的作用与性别因素无显著相关性。

综上所述，预防应用艽龙胶囊可减轻无水乙醇联合阿司匹林诱导的胃黏膜损伤，同时可以改善胃黏膜中壁粘膜组织中MPO及SOD表达水平，抑制粘膜损伤。