Egr1-survivin shRNA转染联合放疗下调survivin表达对 食管鳞癌KYSE150细胞放疗敏感性的影响

陆艳荣 张鑫 吕茵 张瑾熔 王海峰

(新疆医科大学附属肿瘤医院胸腹放疗科，乌鲁木齐 830011)

食管癌是常见的消化系统恶性肿瘤[1-3]，放射治疗是不能手术的中晚期食管癌最主要的治疗手段[4]，但放射治疗的效果并不令人满意，张安度等[5]报道采用三维适形放疗技术食管癌放疗的5年生存率也只有24.5%，而杨民生等[6]早年报道单纯放疗局部未控或复发率高达68.6%，说明局部未控或复发仍然是放疗失败的首要原因。为进一步提高食管癌放疗局部控制率，迫切需要确定食管癌放疗抵抗的内在分子机制并依此开发新的治疗方法。survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proreins，IAPs)家族最小的成员，其主要功能为抑制凋亡及调节细胞周期。其具有在胚胎及胎儿组织及大部分恶性肿瘤组织中高表达，在成年人正常成熟组织中不表达的独特表达方式[7]。文献研究表明其在食管癌组织亦为高表达[8]，下调其表达可增加食管癌放射敏感性[9]，是食管癌理想的治疗靶点。Egr1基因属于即刻早期基因家族(immediate early genes，IEGs)的成员，其启动子含有辐射感应组件，使其能被放射线所诱导而表达增高。利用这个特点，有学者提出了将Egr1基因的启动子序列与需要表达的基因序列连接，用电离辐射驱动Egr1基因的启动子带动目的基因高表达的基因-放射治疗理论[10]。基于以上研究，我们利用的Egr1基因启动子，构建Egr1-survivin shRNA质粒，转染食管癌食管鳞癌KYSE150细胞，并联合放疗，靶向下调survivin表达，来研究此种方法相比于survivin抑制剂YM155联合放疗，是否会进一步促进食管癌细胞凋亡，增加食管癌细胞的放射敏感性，以此探索与放疗联合增加食管癌局控率的新方法。报告如下。

1 材料与方法

1.1材料 细胞株：KYSE150细胞购自中国典型培养物保藏中心。pAAV-EGR1 promoter-survivin shRNA质粒由武汉维诺赛生物技术有限公司合成。细胞培养于RPMI-1640+10%胎牛血清+1%双抗的培养基中。LipofectamineTM2 000转染试剂(invitrogen)，Trizol(Aidlab)，HiScript Reverse Transcriptase (RNase H)、50×ROX Reference Dye2、SYBR Green Master Mix(VAZYME)，Taq Plus DNA Polymerase(TIANGEN)，RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天)，兔多抗GAPDH(杭州贤至生物)，兔多抗survivin(武汉三鹰生物)，兔多抗Caspase3(北京博奥森生物)，兔单抗Caspase9(CST)，HRP标记羊抗小鼠二抗、HRP标记羊抗兔二抗(武汉博士德生物)，ECL底物液(Thermo)，X光胶片(柯达)，显影定影试剂盒(天津市汉中摄影材料厂)，APC/7-AAD细胞凋亡试剂盒(三箭生物)。

1.2实验方法 (1)细胞分组处理：食管鳞癌KYSE150细胞按照处理方式分为①空白对照组：不加任何处理+放疗，②空载体对照组：转染空载体质粒+放疗，③Egr1-survivin shRNA组，转染pAAV-EGR1 promoter-survivin shRNA质粒+放疗，④YM155组，YM155处理+放疗。每组设置3个复孔。转染用LipofectamineTM2 000 脂质体转染法，具体操作步骤依照转染试剂盒说明书。测定食管癌KYSE150细胞YM155的IC50值为5 nM。向加入细胞培养的6孔板加入YM155溶液，调节YM155的终浓度为5 nM。转染及YM155处理48 h后进行细胞照射，照射方法为：6MV-X 射线进行室温垂直照射，剂量率200 cGy/min，10 cm×10 cm照射野，100 cm源皮距，照射剂量单次4 Gy，照射后24 h收获细胞进行各项检测。(2)qPCR检测各处理组细胞survivin mRNA水平:利用Trizol法提取细胞总RNA，测定RNA的纯度和浓度后，取1 ug按逆转录试剂盒说明书合成cDNA。合成的cDNA做10倍稀释，进行qPCR检测。qPCR反应体系：cDNA 4 ul，Forward Primer (10 uM)0.4 ul，Reverse Primer (10 uM)0.4 ul，SYBR Green Master Mix 10 ul，50×ROX Reference Dye2 0.4 ul，ddH2O 4.8 ul；反应条件：50 °C 2 min，95 °C 10 min；95 °C 30 sec ，60 °C 30 sec，40 cycles。绘制溶解曲线，最终数据以2-△△Ct进行分析。survivin引物序列：F: 5‘-CCCTTTCTCAAGGACCACCGCATCT-3’，R: 5‘-CTCGTTCTCAGTGGGGCAGTGGATG-3’。GAPDH引物序列：F: 5‘-AAGCCGTTCTTGACAAATGG-3’，R: 5‘-ATTGGTGTTGGCCTTCAGAC-3’。(3)Western Blot检测各处理组细胞survivin、Caspase3及Caspase9蛋白水平：向按分组处理好的细胞加入RIPA裂解液，于冰上充分裂解后收集上清至预冷EP管中，于4 ℃下12 000 rpm离心5 min。取上清用BCA法测定蛋白浓度。后将提取的蛋白充分变性，调整每个样品蛋白上样量为40 ug，进行SPS-PAGE电泳，电泳结束后在0 ℃恒流条件下电转膜，转膜条件：survivin 200 mA，50 min；Caspase3 200mA，70min；GAPDH、Caspase9 200mA，90min。将蛋白转移至PVDF膜上后用含5%脱脂奶粉的TBST封闭、洗膜后，进行抗体杂交，经一抗、二抗孵育后X光显影，扫描胶片，用BandScan分析胶片灰度值进行分析。(4)流式细胞仪检测各处理组细胞凋亡：将按不同分组处理后细胞培养箱培养24 h后，0.25%胰酶消化细胞，12 00 rpm，5 min离心，分别收集各处理组细胞。细胞凋亡检测：加PBS洗涤2次，按照APC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒操作说明进行：A. 加入500 uL Binding Buffer，重悬细胞；B. 5 uL 7-AAD混匀后加入5 uL APC，混匀；C. 室温避光反应5～15 min，流式细胞仪上机检测细胞凋亡。

2 结 果

2.1各处理组细胞survivin mRNA的表达结果 从表1、图1的qPCR检测结果可见，Egr1-survivin shRNA+放疗组KYSE150细胞survivin mRNA的表达量明显低于单纯放疗的空白对照组和空载体对照组，亦低于YM155+放疗组。与3个对照组间的差异均有统计学意义(P<0.01)。

表1 KYSE150细胞各处理组survivin mRNA 表达结果

注：1.空白对照组，2.空载体对照组，3.Egr1-survivin shRNA组，4.YM155组。图1 KYSE150细胞各处理组survivin mRNA表达结果

2.2各处理组细胞survivin蛋白、Caspase3及Caspase9裂解碎片的表达结果 从表2、图2、3的Western-Blot检测结果可见，Egr1-survivin shRNA+放疗组KYSE150细胞survivin蛋白的表达量明显低于单纯放疗的空白对照组和空载体对照组及YM155+放疗组，与3个对照组间的差异均有统计学意义(P<0.01)。Caspase3及Caspase9裂解碎片检测量明显高于三个对照组，与3个对照组间的差异均有统计学意义(P<0.01)。

表2 各处理组KYSE150细胞survivin蛋白、Caspase3、 Caspase9裂解碎片表达量

注：1：空白对照组，2：空载体对照组，3：Egr1-survivin shRNA组，4：YM155组图2 各处理组KYSE150细胞survivin蛋白、Caspase3、 Caspase9裂解碎片表达结果

注：1：空白对照组，2：空载体对照组，3：Egr1-survivin shRNA组，4：YM155组图3 各处理组KYSE150细胞survivin蛋白、 Caspase3、Caspase9裂解碎片表达结果

2.3流式细胞仪检测KYSE150细胞各处理组凋亡的结果 从表3细胞凋亡检测结果可见，Egr1-survivin shRNA组及YM155组凋亡率均明显高于空白对照组和空载体对照组，Egr1-survivin shRNA组与YM155组相比凋亡率也明显增加，Egr1-survivin shRNA组与其他三组的细胞凋亡率差异均有统计学意义(P<0.01)。

表3 KYSE150细胞各处理组凋亡检测结果

3 讨 论

食管癌我国是常见的消化系统肿瘤，发病率为常见恶性肿瘤第6位[11]。一直以来放疗都是食管癌的主要根治方法之一，但放疗的疗效并不令人满意。据祝淑钗等[12]对500例中晚期食管癌的疗效分析显示，全组 1 、3、5 年生存率分别为 71.1%、32.6 %、20.8%。即便是经过严谨统计设计的NEOCRTEC5010研究，其结果显示对于潜在可切除的胸段食管鳞癌，术前同步放化疗组的pCR率为43.2%，OS为100.1月，虽较以前的治疗模式有明显提高[13]，但与其他常见恶性肿瘤的疗效相比，食管癌放疗的生存期仍不能令人满意，急需探索新的治疗靶点和治疗理念。

survivin蛋白与食管癌的发生及进展密切相关，Dabrowski等[14]研究显示survivin在食管鳞癌标本中表达明显升高，其阳性率可达83.33%，而且文献显示其过表达与患者较差的预后相关[15]。Egr1基因启动子区含有CArG盒/CC(A+T-rich)GG区的特殊结构，使Egr1基因能被放射线所诱导而表达增高。利用这一特点，我们以survivin做为治疗的靶点，利用可被电离辐射诱导的Egr1基因启动子，构建Egr1-survivin shRNA质粒，转染食管鳞癌KYSE150细胞后用X射线照射，测定细胞内survivin的mRNA表达和蛋白水平的变化情况，来观察Egr1-survivin shRNA联合放疗下调survivin表达后对KYSE150细胞凋亡的影响，以确定这种干预否会进一步增加食管癌细胞的放射敏感性，促进食管癌细胞死亡。

通过siRNA方法可下调survivin的表达是一种常用的干扰survivin表达的方法，文献报道证实了这种方法的可靠性，这种处理的结果为促进癌细胞凋亡，增加癌细胞对放疗的敏感性[16]。我们的研究通过增加survivin shRNA的表达来抑制survivin表达，其结果显示Egr1-survivin shRNA转染后经放疗诱导，KYSE150细胞survivin mRNA及蛋白的表达水平均较对照组明显下调，证实Egr1-survivin shRNA质粒合成是成功的，经放射线诱导后起到了预期的效果，Egr1启动子确实带动了合成质粒中位于其下游的survivin shRNA表达增加，并进而降低了survivin mRNA及蛋白的表达。YM155是一种靶向survivin的小分子药物，其可以在mRNA及蛋白水平强烈抑制survivin的表达[17]。实验研究显示其可增加人非小细胞肺癌细胞对于γ射线的敏感性，与单纯照射相比，其与γ射线联合可明显增加癌细胞放射敏感性，促进裸鼠非小细胞肺癌移植瘤的缩小[18]。本研究也显示YM155+放疗处理处理后，KYSE150细胞survivin mRNA及蛋白的表达水平较空白对照组及空载体组均明显下调，显示出与文献报道相一致的survivin基因的表达抑制作用，可作为本研究的适宜阳性对照。虽然有以上多种靶向survivin研究探索，但现有的无论siRNA还是以YM155为代表的小分子抑制剂，都存在一定的缺陷，未能真正应用于临床[19]。故此我们希望通过基因-放射治疗的理念来探索靶向survivin新治疗思路。

本研究将Egr1基因的启动子与survivin shRNA连接构建重组质粒并联合放疗，这种方法的优势在于，既可发挥放疗局部杀伤肿瘤细胞的作用，又可通过放疗诱导survivin shRNA表达增加，从而起到比siRNA方法更强的促进食管癌细胞凋亡的作用。其研究结果显示，Egr1-survivin shRNA+放疗处理后，KYSE150细胞survivin mRNA及蛋白的表达水平明显下调，与凋亡相关的Caspase3、Caspase9蛋白碎片的检出量明显增加，说明内源性及外源性通路的凋亡均增强；并通过流式细胞术检测到了此处理组细胞凋亡率明显的增高，表明Egr1-survivin shRNA转染+放疗可通过抑制survivin表达、增加细胞凋亡的途径，明显增加食管癌细胞的放射敏感性。

本研究结果表明Egr1-survivin shRNA+放疗对于survivin表达的抑制在所有处理组中是最强的，相较于单纯放疗、YM155处理+放疗，可更大程度地降低survivin的表达。且经Egr1-survivin shRNA转染降低survivin达后联合放疗，其促凋亡作用也强于YM155+放疗处理，证实此种方法相比于YM155处理，对于食管鳞癌细胞具有更强的放射增敏作用。由此可得出：Egr1-survivin shRNA联合放疗可进一步增加食管鳞癌细胞放疗敏感性，是一种有前景的食管癌治疗基因-放疗思路，值得进一步研究。因本实验为细胞学研究，其得出的结论还有待于动物实验及人体的临床试验进一步证实。