测定牡蛎糖原含量的微量反应体系的建立与优化

陈 夕 ，吴 彪 ，王 岩 ，孙秀俊 ，周丽青 ，刘志鸿

（1. 中国水产科学研究院黄海水产研究所/农业农村部海洋渔业可持续发展重点实验室，山东 青岛 266071；2. 上海海洋大学/水产科学国家级实验教学示范中心，上海 201306； 3. 青岛海洋科学与技术试点国家实验室/海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室，山东 青岛 266071）

糖原，又称动物淀粉，是由葡萄糖脱水缩合作用而成的一种多糖，作为动物储存糖类的主要形式，在体内主要发挥能量储存功能[1]，同时还具有解酒保肝、抗疲劳、抗肿瘤等生物活性[2]。糖原是大多数水产贝类体内最直接有效的储能物质，在其生理代谢等方面发挥着重要作用[3]。牡蛎因富含糖原、牛磺酸和锌等营养物质，素有“海中牛奶”之称[4]，是我国海水养殖贝类的主导种类，也是世界贝类养殖产业中范围最广、产量最高的类群[5]。随着人们生活水平的不断提高和牡蛎消费群体的不断扩大，人们对牡蛎的肉质品质，尤其是味道鲜甜的口感提出了更高要求。研究表明，牡蛎软体部糖原与其口味明显相关，是牡蛎的主要呈味物质之一，其含量通常占干质量的20%～40%，可以直接被人体吸收利用[6-7]。2019年通过全国水产原种和良种审定委员会审定的牡蛎新品种中，长牡蛎“鲁益1号”和长牡蛎“海蛎1号”的优良性状均以高糖原含量为主要性状特点。因此，高糖原牡蛎将可能是未来牡蛎市场的主导产品。

准确、高效的性状测定是进行品质改良的前提。目前，水产贝类糖原含量的测定方法主要有传统蒽酮比色法、基于蒽酮比色法基本原理的试剂盒法和近红外 (NIR)光谱分析法[8-11]。传统蒽酮比色法实验步骤较为繁琐，样品预处理复杂。试剂盒法成本过高，且两种方法对蒽酮、硫酸等试剂的消耗量均较大，难应用到大批量样品的测定工作[12]。NIR光谱分析法需要构建模型，而模型的建立需要依赖前期大批糖原含量的准确测定。微量蒽酮反应体系测定糖含量首先由Leyva等[13]提出，主要依托于实验室的多道移液枪、微孔板、酶标仪等现代化设备以更小的体系对样品进行批量处理，具有试剂耗材用量少、成本低等特点，早期应用于药品中总糖的高通量测定。随后在植物领域中，韩烨等[14]构建了微量滴定蒽酮法并用于甜玉米芯可溶性糖的测定，张述伟等[15]应用此方法批量测定大麦叶片中可溶性糖的含量，该方法显著提升了测定效率。

目前，在动物组织糖含量测定相关研究中，微量反应体系较为少见，尚没有用微量反应体系测定牡蛎软体组织糖原或可溶性糖含量的相关报道。本研究以近江牡蛎(Crassostrea ariakensis) 为材料，通过优化反应体系组分用量、反应时间等重要实验条件，以期建立一种简单快捷、准确高效的牡蛎糖原含量的微量蒽酮比色测定方法，为实现牡蛎糖原快速、准确测定提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验材料为近江牡蛎，采自于山东东营海区。活体运回实验室后，解剖取外套膜、鳃、唇瓣、性腺、肝胰腺、闭壳肌，将其冷冻干燥48 h；研磨成粉后，称取(20±1) mg样品于10 mL试管中；使用移液枪加入30% (w/w) 氢氧化钾 (KOH) 溶液2 mL，沸水浴消化45～60 min，期间每隔5～10 min摇晃试管，使其消化完全。蒸馏水定容至5 mL，12 000 r·min−1离心8 min，取上清液即为样品待测液，−80 °C保存待测。所用试剂均为优级纯。

1.2 微量反应体系的建立与优化

1.2.1 微量蒽酮比色法建立 0.2%蒽酮硫酸溶液的配置：根据使用量称取蒽酮 (蒽酮>98.0%，Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.)，加入500倍体积的浓硫酸 (优级纯)，即得蒽酮硫酸溶液，现配现用，避光放置。

取稀释10倍的牡蛎待测液100 μL于EP管中，冰浴5 min，取200 μL蒽酮硫酸溶液于冰浴条件下贴管壁缓慢加至EP管中。所有样品统一摇匀，之后放入沸水浴加热8 min，期间迅速颠倒混匀2次 (每次不超过5 s)，沸水浴完成后用自来水冷却。室温静置30 min，移取200 μL于微孔板，利用酶标仪测定620 nm处吸光值，每个样品重复测定3次。

用1 mg·mL−1的葡萄糖标准液配置成不同浓度梯度的葡萄糖溶液，替代上述的待测液，按照上述方法进行实验，测定吸光值，绘制浓度与吸光值的标准曲线，建立回归方程y=ax+b，其中x为反应体系中葡萄糖浓度，y为吸光值，a为斜率，b为截距。

测得吸光值后，由标准曲线计算得到反应体系中葡萄糖的质量浓度，根据以下公式计算样品糖原的质量分数：

式中C为样品糖原质量分数 (mg·g−1)；C0为根据标准曲线计算得到检测液中葡萄糖的相当含量 (mg·mL−1)；V为样品消化完成后最终定容时的体积，在本实验中为5 mL；W为所取样品质量 (g)；D为待测液在测定过程中的稀释倍数，在本法中为10；0.9为葡萄糖与糖原之间的转换系数，即100 μg葡萄糖与蒽酮试剂显色相当于90 μg糖原与蒽酮试剂显色。

1.2.2 反应体系的优化 吸光值大小表示蒽酮与糖的反应程度，能够说明反应是否完全，反应不充分或者反应过度都会导致吸光值偏低。因此，将吸光值作为评价标准，吸光值最大的反应体系作为最优体系。构建微量反应体系与常规用量反应体系，并设置不同蒽酮硫酸与葡萄糖标准液的比例，以确定最佳蒽酮硫酸用量，并比较两种反应体系的差异。微量反应体系：取0.1 mg·mL−1葡萄糖标准溶液100 μL，分别设置 200、300、400 μL 3组蒽酮硫酸用量，记为A、B、C，根据1.2.1提供的方法测定每组的吸光值；参考传统蒽酮比色法构建常规反应体系：常规反应体系中标准溶液与蒽酮硫酸用量是微量反应体系用量的10倍，即0.1 mg·mL−1葡萄糖标准溶液1 mL，蒽酮硫酸用量分别为2、3、4 mL 3个水平，记为A1、B1、C1，反应体系置于试管中反应，其余条件、步骤同1.2.1的方法一致，最后测定吸光值。

1.2.3 反应时间的优化 反应时间也是影响吸光值大小的一个重要因素。根据方法1.2.2优化结果确定的最佳微量反应体系，设置沸水浴反应时间分别为0、2、4、6、8、10、12和14 min，测定0.1 mg·mL−1葡萄糖标准溶液吸光值，将吸光值大的反应时间确定为最优反应时间。

1.3 微量蒽酮比色法方法评价

1.3.1 标准曲线线性评价 标准曲线R2是评价标准曲线线性的指标。用1 mg·mL−1葡萄糖标准液配置成0.2、0.1、0.05、0.025、0.012 5 mg·mL−1质量浓度梯度的葡萄糖溶液，蒸馏水为空白对照，利用方法1.2建立的最优微量反应体系和反应条件进行实验，测定标准品吸光值，实验重复5次，绘制标准曲线，计算R2。

1.3.2 重复性评价 变异系数 (CV) 是评价标准曲线重复性的指标，表示数据间的离散程度，CV=标准差/平均值。CV越低，说明重复性越好。本研究中CV由上述不同浓度下葡萄糖标准品与蒽酮硫酸反应的5次重复实验的吸光值计算得到。

1.3.3 方法最低检出限 方法检出限 (CL) 指一个给定的分析方法在特定条件下能以合理的置信水平检出被测物的最小浓度，它是表征分析方法最主要的参数之一。根据国际理论化学和应用化学联合会 (IU-PAC) 的规定计算而得：

式中K为置信因子 (一般取3)，SD为空白样品标准偏差，M为标准曲线在低浓度范围内的斜率[16]。

1.3.4 稳定性评价 批量测定样品需要较长时间完成，反应产物的稳定性直接影响到吸光值的准确性。利用近江牡蛎6种组织为实验材料，根据上述建立的微量蒽酮比色法的最佳条件完成实验反应，显色反应完成后，室温静置30、60、90、120 min，分别测定吸光值，评估其稳定性。

1.3.5 准确性评价 利用加标回收率评价本法的准确性。取近江牡蛎闭壳肌、腮、外套膜、肝胰腺、唇瓣、性腺的待测液，根据上述构建的方法并使用最佳条件对待测液糖原含量进行第一次测定。然后根据第一次测定结果，在待测液中加入与第一次测定结果大约相等的葡萄糖标准品，使用相同的方法对待测液再次进行测定。根据两次测定结果与加标量计算加标回收率，即：加标回收率=(加标试样测定值−试样测定值)/加标量×100%。

1.3.6 近江牡蛎糖原含量不同测定方法的比较 利用近江牡蛎闭壳肌、外套膜、鳃、肝胰腺、唇瓣和性腺，比较分析微量蒽酮比色法、传统蒽酮比色法和试剂盒法测定牡蛎糖原含量的差异性。微量蒽酮比色法依据上述建立的技术方法进行，传统蒽酮比色法参照Carroll等[17]的方法，试剂盒法参照李春燕[9]的方法进行。所有测定均重复3次。

1.4 统计学分析

本实验所得数据均采用SPSS 22.0软件处理，显著性差异分析采用t检验，差异显著设置为P<0.05，差异极显著设置为P<0.01。

2 结果

2.1 微量反应体系建立

2.1.1 反应体系优化 微量反应体系与常规用量反应体系的6个反应的实验结果见图1。A、B、C反应体系蒽酮硫酸用量与葡萄糖标准液用量为 200 μL∶100 μL、300 μL∶100 μL、400 μL∶100 μL，A1、B1、C1反应体系蒽酮硫酸用量与葡萄糖标准液用量为 2 mL∶1 mL、3 mL∶1 mL、4 mL∶1 mL。结果显示，蒽酮硫酸与葡萄糖标准液的比例为2∶1时，A、A1组反应体系吸光值最高，分别为0.92±0.03和0.93±0.04，且两组之间无显著性差异。随着蒽酮硫酸与葡萄糖标准液的比例升高，吸光值显著降低，当蒽酮硫酸与葡萄糖标准液的比例为4∶1时(C和C1) 吸光值最低，分别为0.32±0.02和0.35±0.03。

图1 不同反应体系对吸光值的影响不同小写字母表示差异显著 (P<0.05)，图2、图5同此Figure 1 Influence of different reaction systems at absorbance A620Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05). The same case in Figure 2 and Figure 5.

综上，蒽酮硫酸与葡萄糖标准液的比例为2∶1时最优，相同比例下微量反应体系与常规反应体系测定结果无显著性差异，微量反应体系更加节约试剂、操作简便，因此确定反应体系A为最佳反应体系。

2.1.2 反应时间优化 反应时间优化结果见图2，沸水浴反应0、2、4、6、8、10、12和14 min后，第0至第6分钟吸光值呈线性上升，第6至第10分钟上升较缓，第8分钟时的吸光值为0.90±0.010，反应至第10分钟时达到最大值 (0.93±0.012)，之后开始逐渐下降，第14分钟时为0.79±0.021，因此确定最佳反应时间为10 min。

图2 吸光值随反应时间的变化曲线Figure 2 Change curve of absorbance value with reaction time

2.2 微量蒽酮比色法方法评价

2.2.1 线性、重复性评价及方法检出限 线性及重复性分析结果见表1和图3。5条标准曲线的R2介于0.997 9～0.999 5，说明本方法在葡萄糖质量浓度介于0～0.2 mg·mL−1时具有较好的线性关系；变异系数均小于4%，说明本法具有良好的可重复性；计算得出的本法检出限CL为0.001 5 mg·mL−1，说明本法具有较高的灵敏度。由此可见，本方法的线性、重复性较好，且检出限较低。

图3 葡萄糖质量浓度与吸光值的标准曲线Figure 3 Standard curve of glucose mass concentration and absorbance

表1 线性及重复性评价结果Table 1 Linearity and repeatability evaluation results

2.2.2 最终反应体系稳定性评价 使用本法测定牡蛎6种组织吸光值，室温静置120 min，期间每隔30 min测定一次，结果见图4，闭壳肌、外套膜、鳃、肝胰腺、唇瓣和性腺第30分钟时的吸光值分别为0.39、0.97、1.33、0.75、1.84、1.98，第120分钟时的吸光值分别为0.38、0.94、1.30、0.74、1.84、1.97，相同组织的不同测定时间的吸光值无显著性差异，说明反应显色完成后的体系在120 min内可保持稳定。

图4 微量蒽酮比色法稳定性曲线Figure 4 Stability curve of trace anthrone colorimetry

2.2.3 准确性评价 应用上述构建的微量蒽酮比色法，对牡蛎6种组织的糖原含量进行加标回收率测定，表2已将原反应体系中不同组织的糖原含量换算为葡萄糖含量，然后再进行回收率的计算。结果显示使用本法对牡蛎不同组织糖原含量测定的加标回收率介于95.3%～105.8%，具有较高的准确性，说明微量蒽酮比色法可准确测定牡蛎糖原的含量。

表2 牡蛎组织中糖原含量加标回收率实验结果Table 2 Experimental results of recovery rate of glycogen content in oyster tissue

2.2.4 不同牡蛎糖原含量测定方法的比较 使用微量蒽酮比色法、传统蒽酮比色法、试剂盒法测定了牡蛎6种组织中的糖原质量分数，结果见图5。微量蒽酮比色法测得闭壳肌、外套膜、鳃、肝胰腺、唇瓣和性腺的糖原质量分数分别为 (54.57±2.22)、(275.62±8.20)、(529.62±17.46)、(348.80±11.27)、(563.30±14.82)和 (592.74±19.68) mg·g−1。与其余两种方法测得的糖原含量之间无显著性差异，说明上述确立的微量蒽酮比色法可准确测定牡蛎的糖原含量。

图5 不同方法测定牡蛎糖原质量分数Figure 5 Determination of glycogen content in oyster tissues by different methods

3 讨论

目前，糖原含量的测定方法主要有传统蒽酮法、试剂盒法、近红外光谱法和微量蒽酮法，各具优缺点 (表3)。1948年，Morris[18]首次建立蒽酮测定糖含量的方法，1956年Carroll等[17]详细报道了应用蒽酮比色法测定小鼠肝脏糖原含量的实验。虽然此法作为测定糖原含量的经典方法一直沿用至今，但该方法样品预处理复杂，操作十分繁琐，且蒽酮与浓硫酸消耗量较大，不仅工作量巨大，大量浓硫酸的使用也会给实验人员的健康安全带来潜在风险，较难适用于大批量样品的测定工作。目前国内市场上主要有2款糖原测定试剂盒，即肝/肌糖原测定试剂盒 (南京建成，中国) 和糖原含量检测试剂盒 (Solarbio, 中国)，这2种试剂盒降低了蒽酮硫酸的使用量，并在样品处理上做了改进，不再使用乙醇提纯糖原，而是用浓碱将动物组织消化完成后直接用于糖原测定，即便如此，3 mL的总反应体系也相对较大。国外的试剂盒是应用酶将糖原分解为葡萄糖后测定葡萄糖含量，避开了使用浓硫酸等试剂，较为安全，但此法对样品预处理要求极高，操作也非常复杂。相比于传统蒽酮法，虽然试剂盒都做了改进，但其主要的缺点是价格昂贵，不适用于大批量样品的测定。Wang等[19]报道了近红外 (NIR) 光谱分析法高通量测定动物组织糖原含量，但近红外模型的建立依赖于已有多个已知精确糖原含量的样品，且对于样品的广谱性有较高要求，所以模型较适用于与建模样品相对一致样品的测定。同时，此模型建立需要特殊仪器，目前尚未大规模推广。微量蒽酮反应体系具有试剂耗材用量少、成本低等特点，已经在植物研究等领域中应用[14-15]。

表3 糖原含量的测定方法比较Table 3 Comparison of determination methods of glycogen content

在现代贝类遗传育种或贝类生物信息学分析工作中，通常需要大量的基本生物学数据作为支撑条件。由此，构建一种成本低、操作简单快捷、结果准确可靠、可批量测定动物组织糖原含量的方法显得尤为重要。刘思玮[8]、丛日浩[3]、吴怡迪[22]应用改进后的传统蒽酮比色法测定牡蛎组织糖原含量，降低了浓硫酸的用量，每反应使用5 mL蒽酮硫酸显色剂，总反应体系为5.5 mL，完成了大批量的样品糖原测定工作。国内众多学者也是采用3～12 mL不等的较大反应体系[23-29]，即便如此，浓硫酸使用量过大带来的工作量也十分巨大。本方法构建并优化的微量反应体系，蒽酮硫酸溶液用量仅为200 μL，总反应体系仅为300 μL，在EP管中即可进行反应，与常规方法相比浓硫酸用量减少了90%～97%，降低了实验的危险性与实验人员的工作量。不仅如此，应用试剂盒法测定牡蛎样品糖原含量成本较高[9]，进口试剂盒甚至高达每个样品42元 (表3)。而本法的实验成本仅为每个样品0.2～0.4元，大大降低了高通量多重复测定实验的成本。

颜色直接影响吸光值大小，而糖原含量的计算主要依赖于准确的吸光值测定。体系反应充分且反应不过度是准确测量的关键[30]。本研究中，随着反应体系在沸水浴中加热，颜色由淡黄色逐渐变为浅蓝绿色，随后蓝绿色加深，随着反应继续进行，溶液蓝绿色逐渐消失变为青灰色，吸光度下降。其他条件一定，蒽酮硫酸与待测葡萄糖标准液比例的升高，导致吸光度逐渐下降，是由于高浓度硫酸的反应体系会使得反应加快，过度反应，最终反应体系为浅蓝绿色，或蓝绿色完全消失呈现出青灰色，这与张述伟等[15]研究结果一致。同样，随着反应时间的增加使得反应过度，反应体系吸光值呈现出先上升后下降的趋势，这与李晓旭和李家政[31]、韩烨等[14]的研究结果一致。微量蒽酮比色法方法评价中显示，标准曲线R2为0.997 9～0.999 5，且变异系数小于4%，与韩烨等[14]、张述伟等[15]所用方法差别不大。本法检出限为0.001 5 mg·mL−1，优于韩烨等[14]构建的微量蒽酮法的葡萄糖检出限 (0.018 mg·mL−1)。本法最终的反应体系在120 min内可保持稳定，这与张述伟等[15]、任婧等[32]构建的微量反应体系所得结果一致。综上所述，本研究构建的微量蒽酮比色法具有良好的灵敏度、重复性、稳定性和准确性。

本研究使用了上述构建的微量蒽酮比色法、传统蒽酮比色法、试剂盒法共3种方法测定了6种牡蛎组织糖原含量，结果显示所测得的糖原含量无显著性差异。使用微量反应体系在保证测定结果准确可靠的同时，其实验过程更加安全；且微量反应体系的构建使得操作更加简单快捷，实验成本可控，适用于大批量样品的高通量测定。