高效液相色谱-串联质谱法检测宁南霉素在人参中的残留及消解规律

宋雨桐, 陆 洋, 尤庆航, 侯新港, 朱宗利, 孙晓伟,方 楠, 侯志广, 梁 爽, 逯忠斌

(吉林农业大学 植物保护学院，长春 130118)

人参Panax ginsengC. A. Mey 作为药食同源中药材，具有抗疲劳、调节血糖和抗氧化等功能[1-3]。但由于人参的生育周期较长，使得人参易受疫病、灰霉病和根腐病等多种病害的侵扰，造成人参产量损失高达20%～50%[4]。生产中主要应用化学杀菌剂防治人参上的病害，但化学农药的过度使用不仅会造成环境污染，还会对食品安全与人体健康产生影响。因此选择一种高效、安全、低毒、低残留的杀菌剂防治人参疫病显得尤为重要。

宁南霉素是一种从牛链球菌中分离的新型农用抗生素杀菌剂，由中国科学院成都生物研究所创制[5-6]，属于胞嘧啶核苷肽型新抗生素农药，对植物病害具有良好防效，已广泛用于治疗多种作物上的病毒病、茎腐病和白粉病等病害[7]，但尚未在人参上登记使用。

目前，对宁南霉素残留的检测方法主要有高效液相色谱-紫外检测器[8]、液相色谱-串联质谱[9-10]、超高效液相色谱-串联质谱[11]，但由于人参中含有皂苷、多糖、微量元素、挥发油等未知成分导致基质过于复杂[12]，所以上述报道所采用的QuEChERS法和HLB固相萃取柱进行净化后，并不完全适用于人参基质。鉴于此，本研究通过改进上述方法，优化固相萃取净化手段，建立了一种简单、高效测定人参中宁南霉素残留量的高效液相色谱-串联质谱 (HPLC-MS/MS) 分析方法。并通过1年4地的田间试验研究了宁南霉素在人参及其植株中的最终残留量和消解动态，旨在为宁南霉素在人参中最大残留限量标准制定和指导宁南霉素的安全使用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

Agilent 1260-6470高效液相色谱-串联质谱仪(美国 Agilent 公司)；FW-100型谷物粉碎机 (天津市泰斯特仪器有限公司)；KQ-250DE型超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司)；YXJ-A型离心机 (上海安亭科学仪器厂)；0.22 μm有机滤膜 (天津津腾实验设备有限公司)；VORTEX 3型涡旋仪(郑州长城科工贸有限公司)；3205型食品加工机(博朗电器)；IKA RV10型旋转蒸发仪 (郑州长城科工贸有限公司)；自制氮吹仪 (自制)；50 mL离心管 (Biosharp公司)。

宁南霉素 (ningnanmycin，纯度95.0%) 标准品，德强生物股份有限公司；8%宁南霉素水剂(德强生物股份有限公司)；乙腈和甲醇 (色谱纯)，北京迈瑞达科技有限公司；氨水和浓盐酸 (分析纯)，北京化工厂；甲酸 (色谱纯)，天津福晨化学试剂厂；纯净水 (杭州娃哈哈集团有限公司)；500 mg ProElut PLS固相萃取柱和500 mg ProElut PXC固相萃取柱 (北京迪马科技有限公司)。

1.2 田间试验

田间试验于2019年分别在吉林省白山市、抚松县、延吉市和辽宁省桓仁县进行。供试人参品种为大马牙，供试药剂为8%宁南霉素水剂，按《农药残留试验准则》[13]和《农药登记残留田间试验标准操作规程》[14]设计农药消解动态试验和最终残留试验。小区面积为50 m2。在人参疫病发病初期，茎叶喷雾，施药次数为2～3次。

1.2.1 消解动态试验 在人参疫病发病初期，于人参植株茎叶喷雾施药1次，施药剂量为制剂量900 g/hm2(有效成分72 g/hm2)，分别于施药后2 h及0、1、3、7、14、20、30和45 d采集人参植株样品。

1.2.2 最终残留试验 以制剂量900 g/hm2(有效成分72 g/hm2) 在人参疫病发病初期，于人参植株茎叶喷雾施药3次，施药间隔期为7 d，采收间隔期分别为14 和21 d，分别采集人参茎叶及人参(地下肉质根部分) 样品。每个试验小区采集两个独立样品，每个样品单独采集，处理间设保护带。另设清水空白对照。

1.3 样品前处理

1.3.1 干人参样品的制备 按国家标准[15]规定方法。称取 −20 ℃冷冻保存的鲜人参100 g，经铡刀切片后，于80 ℃烘箱中烘干 (宁南霉素的熔点为195 ℃) 24 h后取出，用食品加工机粉碎，过180 μm孔径筛，于4 ℃保存，备用。

1.3.2 样品的提取 准确称取5 g (精确至0.01 g)样品于50 mL离心管中，加入体积分数为0.2%的甲酸水溶液，使总水量为25 mL (约加入22 mL)，涡旋振荡5 min后于4 000 r/min下离心5 min，取上清液，用定性滤纸过滤后待净化。

1.3.3 样品的净化 PLS柱用3 mL甲醇、3 mL体积分数为0.2%的甲酸水溶液预淋洗，弃去淋洗液。取5 mL提取液过柱，收集流出液，待PXC柱净化。PXC柱用5 mL甲醇、5 mL水和 5 mL 30 mmol盐酸溶液预淋洗，弃去淋洗液。取5 mL上述过PLS柱滤液再过PXC柱，待样液流尽后用5 mL水、5 mL甲醇淋洗，弃去流出液。用12 mL体积比为4 : 1的氨水-甲醇溶液洗脱。收集洗脱液，于50 ℃水浴中旋转浓缩至约0.5 mL，氮气吹干，用体积比为1 : 1的乙腈-0.2%甲酸水溶液稀释，定容至2 mL，过0.22 μm微孔滤膜，待测。

1.4 检测条件

色谱条件：Waters XSelect® HSS T3色谱柱(2.1 mm × 100 mm, 2.1 μm)，柱温30 ℃，流速0.3 mL/min，进样体积5 μL，流动相A为体积分数0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸-甲醇混合溶液，梯度洗脱程序见表1。

表1 宁南霉素流动相梯度洗脱条件Table 1 The mobile phase gradient elution conditions for ningnanmycin

质谱条件：电喷雾离子源正离子扫描模式(ESI+)；多反应监测模式 (MRM)；雾化气为氮气；雾化气压力0.31 MPa；毛细管电压3 500 V；干燥气温度350 ℃；干燥气流速10 L/min；鞘气温度380 ℃；鞘气流速11 L/min；宁南霉素定量离子对444.2 > 315.1，源内碎裂电压25 V，碰撞能16 V；定性离子对444.2 > 333.1，源内碎裂电压25 V，碰撞能12 V。

1.5 标准溶液配制及标准曲线绘制

标准储备液：准确称取0.01 g (精确至0.001 g)宁南霉素标准品，用甲醇溶解，配制成质量浓度为 1 000 mg/L 的宁南霉素标准储备液，于0～4 ℃避光密封保存。

标准溶液：用体积比为1 : 1的乙腈-0.2%甲酸水溶液的混合溶液稀释宁南霉素标准储备液，配制成 0.05、0.1、0.2、0.5、1和2 mg/L 的系列宁南霉素标准溶液，于0～4 ℃避光贮存，备用。

基质匹配标准曲线绘制：称取空白鲜人参、人参植株和干人参样品各5 g，按1.3节样品前处理步骤处理后分别用宁南霉素标准溶液稀释，配成系列质量浓度的基质匹配标准溶液，外标法定量。以宁南霉素质量浓度 (x) 为横坐标，峰面积 (y)为纵坐标，绘制标准曲线，建立线性回归方程。

1.6 添加回收试验

分别向空白样品中添加宁南霉素标准溶液，鲜人参和人参植株添加水平为0.1、0.2和1 mg/kg干人参添加水平为0.2、1和2 mg/kg。每个水平重复5次，另设空白对照。按1.4节条件进行测定，计算添加回收率和相对标准偏差 (RSD)。

2 结果与分析

2.1 色谱条件优化

比较了甲醇 (含0.1%甲酸)-水 (含0.1%甲酸)、乙腈 (含0.1%甲酸)-水 (含0.1%甲酸)、甲醇-水 (含0.1%甲酸) 和乙腈-水 (含0.1%甲酸)4种不同的流动相组合对宁南霉素色谱峰的影响。由图1可知：当有机相为甲醇 (含0.1%甲酸) (a)、乙腈 (含0.1%甲酸) (b) 时宁南霉素的响应值明显高于甲醇 (c)、乙腈 (d)，这是由于宁南霉素的化学结构使其在正离子模式下，能与甲酸中的H+结合，可以更好地提高宁南霉素的离子化效率，提高整体的响应值[16]。鉴于宁南霉素在酸性条件下更稳定，所以向溶剂中加入0.1%甲酸，优于纯溶剂。无论是否添加0.1%的甲酸，当有机相为甲醇时，宁南霉素的色谱峰分离程度与响应值均明显高于有机相为乙腈时，这是因为相比于非质子性的乙腈，质子性的甲醇对加氢峰的农药母离子测定其质谱峰面积的响应更大，而乙腈偏碱性，具有更强的质子亲和力，在ESI过程中更容易捕获质子使其自身离子化，从而抑制农药的加氢峰母离子生成，使农药质谱峰面积响应降低[17]。基于上述条件优化，选用甲醇 (含0.1%甲酸)-水 (含0.1%甲酸) 为流动相。

2.2 提取溶剂与提取方法的优化

由于宁南霉素易溶于水，可溶于甲醇，难溶于丙酮、苯等溶剂[18]，所以本研究选用了0.2%甲酸水溶液 (酸性)、10%甲醇水溶液 (中性) 和0.1%氨水溶液 (碱性) 3种不同pH值的水性溶剂进行提取。结果表明：在提取溶剂中加入适量的甲酸可以使宁南霉素在提取溶剂中更加稳定，回收率为99%，而在碱性条件下易分解失活，回收率仅为2.4%，因此采用0.2%甲酸水溶液作为提取溶剂。

试验通过比较涡旋振荡法、超声波法和匀浆法提取人参中宁南霉素的回收率发现，三者的回收率均在90%左右，但由于匀浆过程中需要反复清洗刀头，操作过程复杂，且易产生交叉污染。超声跟涡旋振荡虽不存在交叉污染的问题，但超声所需时间较长。综合考虑，最终采用涡旋振荡法提取5 min。

2.3 净化方法的优化

由于人参基质含有皂苷、挥发油等多种成分，若提取后直接测定，会对目标化合物的检测产生严重干扰，因此需对提取液净化。分别考察了分散固相萃取法 (d-SPE) 和固相萃取法 (SPE) 对宁南霉素净化效果的影响。

2.3.1 分散固相萃取法 样品经0.2%甲酸水溶液提取，采用分散固相萃取法，使用N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基甲硅烷基 (C18) 和石墨化碳黑(GCB) 净化。结果表明：d-SPE法对人参中杂质的去除能力差，吸附剂在吸附极性与非极性杂质的同时也会吸附目标化合物，从而降低了宁南霉素在质谱的离子化程度。

2.3.2 固相萃取法 分别考察了PLS (6 mL，500 mg，DIKMA公司)、C18(6 mL，500 mg，DIKMA公司)、PXC (6 mL，500 mg，DIKMA公司) 、PEP (6 mL，200 mg，Agilent 公司) 和HLB (12 mL，500 mg，SUPELCO公司) 5种固相萃取柱的净化效果。结果 (表2) 显示：5种固相萃取柱单独使用时, 宁南霉素的回收率均未达到农药残留分析要求[13]；而采用PLS＋PXC固相萃取柱串联使用，很好地解决了人参基质过于复杂导致的净化效果不足和吸附交换能力不足等问题，减少了宁南霉素在人参样品中存在的杂质干扰影响和回收率偏低两个关键问题。

表2 不同固相萃取柱对宁南霉素回收率影响Table 2 The influence of different SPE cartridges on ningnanmycin recoveries

2.4 方法的线性范围、定量限、准确度及精密度

结果如表3所示：在0.05～2 mg/L范围内，不同基质中，宁南霉素的质量浓度与响应值有良好的线性关系。

表3 宁南霉素在人参中的线性范围、回归方程与定量限Table 3 Linear range, regression equation and limit of quantification of ningnanmycin in ginseng

由表4可知：宁南霉素在鲜人参中的平均回收率为90%～99%，相对标准偏差 (RSD) 为4.7%～5.6%；在人参植株中的平均回收率为92%～94%，RSD为4.0～5.6%；在干人参中的平均回收率为89%～95%，RSD为1.4%～10%。该结果表明所选定的方法符合农药残留分析的要求[13]。

表4 宁南霉素在人参中的添加回收率和相对标准偏差 (n = 5)Table 4 The recoveries and relative standard deviation of ningnanmycin in ginseng (n = 5)

2.5 宁南霉素在人参植株中的消解动态

2019年白山、桓仁两地人参植株上的消解动态结果见表5。从中可看出，由于宁南霉素易降解的特性导致宁南霉素在人参植株中消解较快，且本试验的LOQ为0.1 mg/kg等原因，导致消解动态数据中的部分数值低于本试验的LOQ，致使消解曲线拟合时少于5个点，拟合的曲线R2值不高，所以本试验以3倍信噪比计算出宁南霉素的检出限 (LOD) 为0.02 mg/kg，以高于LOD的数值模拟建立一级动力学方程，得到的半衰期为0.76 d(桓仁)、11.77 d (白山)。宁南霉素在白山人参植株中的消解要比桓仁慢，可能与喷洒过程中人参植株的受药面积和采样均匀程度有关，还可能是受宁南霉素自身的理化性质影响，由于宁南霉素属于生物农药，极易被日光、植物或土壤微生物分解，而在试验过程中桓仁的平均日照数、施药期间的降雨量和平均气温均大于白山，导致宁南霉素在白山人参植株中的半衰期较长。

表5 宁南霉素在人参植株中的消解动态Table 5 Dissipation dynamics of ningnanmycin in ginseng plants

2.6 宁南霉素在人参中的最终残留量

试验结果见表6。从中可以看出，宁南霉素在鲜人参和干人参上的最终残留量均低于LOQ；在人参植株上的最终残留量为

表6 宁南霉素在人参中的最终残留量Table 6 Terminal residues of ningnanmycin in ginseng

3 结论与讨论

本研究建立了固相萃取法检测人参中宁南霉素残留的分析方法，比较了不同酸碱度提取体系与不同提取方式对宁南霉素回收率的影响，考察了不同固相萃取柱对其净化效果的影响，优化了前处理提取和净化的过程。该方法简单、高效、准确，通过以PLS+PXC固相萃取柱萃取，有效地实现了样品净化，通过基质匹配标准溶液外标法定量，方法验证结果符合中国《农作物中残留试验准则》要求。

应用所建立的方法检测吉林省白山市、抚松县、延吉市及辽宁省桓仁县人参中宁南霉素的残留量。结果表明，宁南霉素在人参植株上估算半衰期为0.76～11.77 d。当样品采收间隔期为14、21 d时，鲜人参和干人参中宁南霉素的残留量均低于LOQ；人参植株中宁南霉素的残留量为

目前我国规定宁南霉素在稻米与糙谷中的临时限量为0.2 mg/kg、在番茄、黄瓜和苹果中的临时限量为1.0 mg/kg、在香蕉中的临时限量为0.5 mg/kg[19]，暂未设定宁南霉素在人参中的最大残留限量 (MRL)。综上所述，为达到防治人参疫病同时降低农药残留的目的，建议我国宁南霉素在鲜人参中的MRL值为0.2 mg/kg，人参植株中的MRL值为0.5 mg/kg，干人参中的MRL值为0.5 mg/kg。建议将8%宁南霉素水剂在人参上登记使用，并推荐其用于防治人参疫病时，推荐施药剂量675～900 g/hm2(有效成分54～72 g/hm2) 施药3次，安全间隔期为14 d，收获期人参安全。