基于网络药理学分析淫羊藿-三七配伍治疗前列腺癌的潜在靶点及相关机制

刘德果，李姿蓉，赵 姣，陈其华*，苏艺峰

(1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410000；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410008)

前列腺癌是男性发病率最高的恶性肿瘤，但现阶段并无确切有效的治疗手段[1]。诸多研究表明，中医药在改善前列腺癌患者具体症状、调控其精神心理状态等方面具有明显的疗效[2]。

中医古籍并无本病的记载，但根据其临床表现及病机可归于“癥瘕”“癃闭”“尿血”等疾病[3]。中医学认为，前列腺癌病在男性之精窍，与肾、脾、肝等脏密切相关，脾肾虚衰，阴阳失调为发病之因，情志饮食伤及脏腑为起病之源，瘀毒久积、邪郁下焦为致病之标，在治疗上多以扶正祛邪为治疗原则，而“淫羊藿-三七”配伍是临床上较常使用的温阳活血抗癌药对。现阶段对淫羊藿、三七单味药的药效或药理学相关研究较多，但对于“淫羊藿-三七”配伍应用于治疗前列腺癌的药效机制的报道较少，具体作用机制尚未明确。本文基于网络药理学研究方法，进行“药物-成分-靶点-疾病”网络可视化分析，在系统层面及分子水平对“淫羊藿-三七”配伍的药物活性成分、潜在治疗关键靶点以及相关机制进行研究，以期对“淫羊藿-三七”配伍治疗前列腺癌的科学内涵进行探讨，同时为接下来的基础研究验证“淫羊藿-三七”配伍作用机制提供证据。

1 材料与方法

1.1 筛选淫羊藿及三七的药物有效活性成分与药物靶点

本研究借助TCMSP及TCMID等数据库检索淫羊藿及三七的药物有效活性成分与药物靶点基因，筛选标准为：OB>30%，DL>0.18，HL>4 h。之后选择TCMSP数据库的“Related Targets”模块，得到淫羊藿和三七的所有药物靶点基因。

1.2 获取前列腺癌疾病靶点基因

以“Prostate cancer”为关键词，在GeneCards数据库(https：//www.genecards.org)以及OMIM数据库(https：//omim.org/)中进行检索。在完成关键词检索后将上述两个数据库获得的前列腺癌相关基因进行合并剔除重复项后建立“前列腺癌疾病靶点基因数据库”备用。将淫羊藿、三七的药物靶点基因与前列腺癌疾病靶点基因进行映射，获得“淫羊藿-三七”配伍治疗前列腺癌的靶点基因。

1.3 “药物-成分-靶点-疾病”网络可视化分析

将淫羊藿、三七治疗前列腺癌的靶点基因和步骤1.2筛选获得的淫羊藿、三七活性成分进行映射，对药物活性成分和靶点基因的关联进行构建，获得“淫羊藿-三七”配伍治疗前列腺癌的药物活性成分和关键靶点基因。Cytoscape软件多用于构建生物分子相互作用的网络可视化分析。结合前述步骤获得的数据建立“Ingredient_Drug”“Ingredient_Target”“Disease_Target”“Drug_Disease”文件，将其导入Cytoscape3.7.1中进行网络可视化分析。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络分析

借助STRING数据库(https：//string-db.org)及CentiScape插件对蛋白质-蛋白质间的关系进行分析，以期构建蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络，展示其中的关键靶基因。

1.5 关键靶基因本体富集(GO)及京都基因与基因组百科全书通路富集(KEGG)分析

借助R软件(Version3.5.2)安装Bioconductor软件包“colorspace”、“stringi”、“clusterProfiler”并运行，将淫羊藿与三七治疗前列腺癌的关键靶基因转换为entrez ID。之后将已完成转换的entrez ID，对PPI网络中的蛋白进行GO富集分析及KEGG富集分析，同时将分析结果以条形图及气泡图形式导出。

2 结果

2.1 淫羊藿及三七的药物有效活性成分与药物靶点

在TCMSP数据库检索关键词“淫羊藿”“三七”分别获得130个和119个活性成分。以OB>30%，DL>0.18，HL>4 h为条件进行筛选，分别筛选出18个淫羊藿及7个三七活性成分，去重后共获得24个“淫羊藿-三七”配伍的有效活性成分。选取“Related Targets”模块，获得1 620个淫羊藿、716个三七所有活性成分对应的靶点基因。“淫羊藿”“三七”配伍的主要有效活性成分见表1。

表1 “淫羊藿-三七”配伍的主要有效活性成分

2.2 前列腺癌疾病靶点基因获取

在GeneCards及OMIM数据库检索关键词“Prostate cancer”，共筛选出11 667个前列腺癌疾病靶点基因。将淫羊藿、三七的药物靶点基因与前列腺癌疾病靶点基因进行映射，共获得64个“淫羊藿-三七”配伍治疗前列腺癌的靶点基因，见图1。

注：“淫羊藿-三七”配伍活性成分对应的靶点基因与前列腺癌相关基因有64个共同靶基因。

2.3 “药物-成分-靶点-疾病”网络构建

将“淫羊藿-三七”与对应活性成分(Ingredient_Drug)、活性成分与关键靶基因(Ingredient_Target)、关键靶基因与前列腺癌对应关系(Disease_Target)、“淫羊藿-三七”与疾病靶点基因(Drug_Disease)以及属性导入到Cytoscape，构建“药物-成分-靶点-疾病”网络，见图2。使用CentiScape插件计算药物活性成分DC，节点的DC越大，提示该节点在网络中权重越大。Quercetin(槲皮素)为69，luteolin(木犀草素)为32，keampferol(山奈酚)为19，Anhydroicaritin(脱水淫羊藿素)为14、8-Isopentenyl-kaempferol为12，位于前五位。由图2可知，网络图中有多个节点及边，提示药物靶点基因与疾病靶点基因之间存在较多的交集作用，充分体现“淫羊藿-三七”配伍是通过多成分、多靶点、多通路协同作用的方式发挥治疗前列腺癌的作用。其活性成分DC较高的药物如槲皮素、木犀草素、山奈酚、脱水淫羊藿素等具有较显著的抗氧化应激、抗细胞凋亡以及调节免疫功能作用，与相关文献报道一致[17-18]。

注：菱形为前列腺癌，六边形为“淫羊藿-三七”配伍，长方形为“淫羊藿-三七”配伍活性成分，椭圆形为关键靶基因，连线代表各节点间相互关系。

2.4 PPI网络构建

把获得的关键靶基因导入于STRING的Multiple proteins模块，置信度为0.4，将PPI.tsv文件导入到Cytoscape软件，获得64个PPI网络基因。以CentiScape插件计算出DC均值为13.7，选取DC大于均值的基因作为核心基因以大于17.8进行筛选，获得26个核心基因，具体见图3。

图3 药物-疾病靶点蛋白相互作用网络

2.5 GO功能富集分析

通过GO功能富集分析笔者共富集到82个生物学过程及功能，经校正排序后对位于前20的生物过程进行条形图展示，具体见图4。“淫羊藿-三七”配伍主要参与的生物过程包括泛素样蛋白连接酶结合、泛素蛋白连接酶结合、核受体功能、直接配体调节序列特异性DNA结合、RNA聚合酶II转录因子结合、类固醇激素受体活性、类固醇结合、RNA聚合酶II转录因子结合、细胞凋亡、雌激素受体结合、激活转录因子结合、类固醇激素受体结合、核激素受体结合、单加氧酶活性、氧化还原过程、激素受体结合、激酶调节活性、转录辅因子结合、组蛋白激酶活性等。

图4 关键靶点基因GO功能富集分析

2.6 KEGG通路富集分析

通过KEGG通路富集分析笔者共富集到56条细胞信号通路，经校正排序后对位于前20的细胞信号通路进行气泡图展示，具体见图5。“淫羊藿-三七”配伍治疗前列腺癌的主要细胞信号通路包括磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)、细胞凋亡、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、内分泌抵抗、肿瘤坏死因子(TNF)、细胞衰老、p53等细胞信号通路。

图5 关键靶点基因KEGG通路富集分析

3 讨论

现阶段，随着对前列腺癌发病及治疗相关机制的研究不断取得进展，其庞杂的病理机制逐渐被揭示，现代医学认为，前列腺癌的形成机制包括肿瘤雄激素受体机制、干细胞形成机制以及炎性刺激相关机制等[4]。诸多临床研究结果显示，“淫羊藿-三七”配伍治疗前列腺癌可获得良好的临床效果。然而，在中药中存在多成分、多靶点的特征，各药物活性成分间相互交集及作用形成了庞杂的相互作用网络，所以给研究者探究其治疗有效成分及相关机制造成了较大的困难。

在本研究中，淫羊藿及三七的药物主要活性成分包括槲皮素、木犀草素、山奈酚、脱水淫羊藿素、8-Isopentenyl-kaempferol等。Mzhelskaya等[5]的研究结果显示，槲皮素能够通过调控细胞周期、肿瘤血管生成因子(VEGF)以及制止耐药基因表达降低前列腺癌细胞的增殖、迁移并诱导其凋亡，其常见的细胞信号通路多为磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)、细胞凋亡等。木犀草素具有显著的抑制前列腺癌细胞增殖功能，李楠等[6]的研究表明，木犀草素能够显著抑制与细胞增殖紧密关联的JAK2/STAT3细胞信号通路以及Ki67的蛋白表达，并在一定程度上呈剂量依赖性。El-Kott等[7]发现，山奈酚能够诱导前列腺癌细胞的细胞周期阻滞于S期，并且可促进前列腺癌细胞凋亡；Sinha等[8]研究表明，山奈酚可抑制雌激素受体alpha(ESR1)使LNcap细胞的侵袭性下降，同时能够抑制上皮间质转化(EMT)。脱水淫羊藿素具有较强大的雌激素活性及抗氧化活性，同时具有促进细胞凋亡功能[9]。8-Isopentenyl-kaempferol目前相关研究较少，有研究显示其与细胞氧化应激机制相关[26]。故“淫羊藿-三七”配伍里的活性成分与前列腺癌的发生、发展及治疗密切相关，对于前列腺癌的治疗有着重要作用。

对构建的“药物-成分-靶点-疾病”网络以及PPI网络进行分析，显示ESR1、AR、CCND1、VEGFA、CASP3、MYC、HIF-1A等核心靶点与众多药物有效成分存在交互作用，并在构建的网络中表现出聚集现象，提示上述核心靶点可作为“淫羊藿-三七”配伍治疗前列腺癌的潜在靶点，值得进一步的实验研究证实。其中雌激素受体(ESR1)是一类固醇类激素蛋白，能够与雌激素特异性结合使其发挥激素生物学效应，干预相关细胞信号通路调控前列腺上皮细胞以及前列腺癌细胞的生长、增殖以及凋亡等生物学过程。关键靶点基因GO功能富集分析结果显示，“淫羊藿-三七”配伍参与的生物过程主要集中于泛素样蛋白连接酶结合、泛素蛋白连接酶结合，核受体功能、转录因子活性、直接配体调节序列特异性DNA结合、RNA聚合酶Ⅱ转录因子结合等转录调控相关功能，以及细胞凋亡、氧化应激等方面[10-13]。上述生物学过程以及功能体现在于“淫羊藿-三七”的有效活性成分调控相应的靶点基因以及细胞信号通路的过程中。KEGG通路富集分析结果表明，上述“淫羊藿-三七”配伍治疗前列腺癌的潜在靶点与磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)、细胞凋亡、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、内分泌抵抗、肿瘤坏死因子(TNF)、细胞衰老、p53等细胞信号通路的调控息息相关，提示上述生物学过程及功能和前列腺癌的发生、发展以及侵袭转移密切相关。上述生物学过程及相关机制表明，前列腺癌的疾病靶点主要集中在细胞凋亡、细胞周期、细胞增殖、分化、迁移以及血管生成等方面。基于此，本研究揭示了“淫羊藿-三七”配伍治疗前列腺癌的多成分、多靶点、多通路协同作用机制可能与磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)、细胞凋亡、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、内分泌抵抗、肿瘤坏死因子(TNF)、细胞衰老、p53等相关，为“淫羊藿-三七”配伍治疗前列腺癌的进一步研究提供一定的借鉴及参考。

本研究分析了药对“淫羊藿-三七”配伍作用的关键潜在靶点以及相关细胞内信号转导通路，提示其能够通过促进细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖、降低内分泌抵抗、杀伤肿瘤细胞以及抑制肿瘤血管生成等途径发挥抗肿瘤作用。初步揭示了“淫羊藿-三七”配伍治疗前列腺癌的潜在调控机制，体现了中药多成分、多靶点、多通路协同作用的特点，为“淫羊藿-三七”配伍药理研究及临床应用提供了理论依据。