LC-MS/MS法测定跳骨片中马兜铃酸I含量

刘嘉澍，妙 苗，李 青，康小凤，樊宝娟

(陕西省食品药品监督检验研究院，陕西 西安 710065)

跳骨片处方由烫骨碎补、煅自然铜、土鳖虫、醋乳香、醋没药、红花、细辛等二十味药材组成，用于治疗骨折、脱臼及新久伤痛等，用于消肿定痛、活血舒筋，促进骨痂生长[1-2]。该品种被国家药典委员会列为年度国家药品标准提高工作(中药)名单，因其组方中包含细辛，故要求针对制剂中马兜铃酸的含量进行限量检查。细辛来源为马兜铃科植物北细辛AsarumheterotropoidesFr.Schmidt var.mandshuricum(Maxim.)Kitag.、汉城细辛AsarumsieboldiiMiq.var.seou1enseNakai，或华细辛AsarumsieboldiiMiq.的干燥根和根茎，含有微量的马兜铃酸I。研究[3-4]表明，马兜铃酸具有肾毒性作用，可引起急性马兜铃肾病、肾小管功能障碍性马兜铃肾病等。同时，跳骨片中细辛为直接粉碎后压片，占处方的2.34%，因此，建立灵敏度较高的测定马兜铃酸I限量检查方法，对保证跳骨片的质量及用药安全具有重要意义。本实验采用LC-MS/MS方法，大幅提高了分析效率[5]，增加了定性的准确性，并确定了最低检测限度，为跳骨片安全评价提供依据。

1 仪器、试药及样品

1.1 仪器

高效液相色谱-三重四级杆质谱系统(美国AB公司)，包括LC30A液相色谱系统，AB Qtrap 5500质谱仪，Analyst工作站；BP211D分析天平(赛多利斯公司)，ME204分析天平(梅特勒公司)，KQ-500DE型数控超声波清洗机。

1.2 试剂与材料

马兜铃酸I(批号：110746-201611)，由中国食品药品检定研究院提供；水为超纯水，乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

1.3 样品

11批跳骨片(批号：190210、190616、190618、190910、191005、200101、200104、200618、200810、201127、201201)，由厂家提供或通过正规渠道购买获得。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Shim-pack Velox C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，2.7 μm)；以乙腈为流动相A，0.1%甲酸为流动相B，按表1进行梯度洗脱；流速0.3 mL·min-1；柱温30 ℃；进样量：1 μL。[6]

表1 流动相梯度洗脱程序[7]

电喷雾离子源(ESI)；正离子检测；电晕放电电流为3.0 A；离子源温度为 500 ℃；离子源气体 1(N2)压力为50 psi；气帘气体(N2)压力为 30 psi；扫描方式为多反应监测模式(MRM)：扫描时间为100 ms，离子对及其他参数见表2[8-10]。

表2 马兜铃酸I质谱分析参数

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品储备液制备 精密称定马兜铃酸I对照品(批号：110746-201611)10.96 mg，至100 mL量瓶中，以70%甲醇作为溶剂，配制成浓度为109.6 μg·mL-1的溶液作为对照品储备液。

2.2.2 供试品溶液制备 取供试品适量，除去包衣，研细，取约2.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250 W，功率40 kHz)30 min，取出，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

2.2.3 细辛药材溶液制备 取对应批次的细辛药材中粉适量，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，同供试品溶液方法制备，作为细辛药材溶液。

2.3 标准曲线与检出限

精密量取马兜铃酸I对照品储备液(浓度：109.6 μg·mL-1)1 mL，置于100 mL量瓶中，加70%甲醇定容至刻度，摇匀，作为线性中间溶液(浓度：1.096 μg·mL-1)；分别精密量取线性中间溶液0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1 mL、2.5 mL、5 mL，各置50 mL量瓶中，用70%甲醇稀释至刻度，即得浓度分别为2.192 ng·mL-1、4.384 ng·mL-1、10.96 ng·mL-1、21.92 ng·ml-1、54.8 ng·mL-1、109.60 ng·mL-1的系列标准溶液，分别进样1 μL至质谱仪中，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标进行线性回归。

结果可得，马兜铃酸I进样量在2.192～109.60 ng·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系，回归方程：y=1 110.976 65x+ 1 504.134 77 (r=0.999 79)。

该方法最低检出量为2.192 pg(S/N=3)，对应跳骨片供试品的检出限为22.7 ng·g-1。

2.4 精密度试验

精密吸取对照品溶液1 μL，连续重复进样6次，按上述条件测定保留时间及峰面积，结果RSD分别为0.30%与0.54%，说明该方法精密度良好。

2.5 回收率试验

取供试品(批号：200101，未检出马兜铃酸I未检出)适量，除去包衣，取约2.2 g，平行9份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入马兜铃酸I对照品溶液(浓度：109.6 ng·mL-1)1 mL，(浓度：1.096 μg·mL-1)0.5 mL、1.5 mL，各3份，按供试品溶液制备方法同法制备，即得。由表3可得，该方法回收率良好。

表3 回收率考察

2.6 稳定性试验

精密吸取对照品溶液及回收率试验中4号加标供试品溶液，分别在0 h、3 h、6 h、10 h、14 h、18 h、24 h按上述方法，测定含量并记录，RSD为0.98%和1.06%。这说明对照品与供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 限度确定[11-12]

2020年版《中华人民共和国药典：一部》收载的细辛质量标准中，在其马兜铃酸I检查项下的限度为“细辛药材及饮片含马兜铃酸I不得过0.001%”；跳骨片处方中细辛用量为7 g，制成总量为300 g，经折算，初步拟定跳骨片中含马兜铃酸I不得过0.23 μg·g-1，见图1。

图1 马兜铃酸I的检出限、限度及样品图谱

2.8 样品含量测定

取11批次的跳骨片，按上述供试品处理方法制备、测定，见表4。

表4 11批样品测定结果

3 讨论

3.1 流动相的选择

本实验分别考察了乙腈-0.1%甲酸(35∶65)，乙腈-0.1%甲酸(50∶50)[13]，乙腈-0.1%甲酸(80∶20)等不同比例等度洗脱的流动相，除出峰时间差异较大外，峰型均有不同程度拖尾或扩散，故采用梯度洗脱并调整出峰时间。按文中流动相梯度洗脱，峰型有明显改善，保留时间合适，样品洗脱较完全，减少了对后续进样的干扰。

3.2 离子对选择

3.3 药材测定

本实验还分别考察了其中5批制剂对应投料的2批药材的含量，其马兜铃酸I含量分别为652 ng·g-1、534 ng·g-1，虽然低于药典要求限度，但仍有检出，且跳骨片制剂为药材原粉入药，更应对其制剂含量进行控制。

本实验建立的马兜铃酸I限量检查方法简便、快捷，灵敏度较高，对跳骨片的临床用药安全和质量控制具有重要的指导作用。同时，笔者认为，鉴于马兜铃酸对肾脏的伤害不可逆，且目前无针对性治疗方法，故应对仍在生产的处方含有细辛、关木通等马兜铃科植物的制剂品种，补充、制定马兜铃酸I的限量控制，并进一步寻找可替代成分，减少用量，以达到用药安全的目的。