LC-MS/MS法测定跳骨片中马兜铃酸I含量

2021-08-26 03:43刘嘉澍康小凤樊宝娟
亚太传统医药 2021年8期
关键词:乙腈供试甲醇

刘嘉澍,妙 苗,李 青,康小凤,樊宝娟

(陕西省食品药品监督检验研究院,陕西 西安 710065)

跳骨片处方由烫骨碎补、煅自然铜、土鳖虫、醋乳香、醋没药、红花、细辛等二十味药材组成,用于治疗骨折、脱臼及新久伤痛等,用于消肿定痛、活血舒筋,促进骨痂生长[1-2]。该品种被国家药典委员会列为年度国家药品标准提高工作(中药)名单,因其组方中包含细辛,故要求针对制剂中马兜铃酸的含量进行限量检查。细辛来源为马兜铃科植物北细辛AsarumheterotropoidesFr.Schmidt var.mandshuricum(Maxim.)Kitag.、汉城细辛AsarumsieboldiiMiq.var.seou1enseNakai,或华细辛AsarumsieboldiiMiq.的干燥根和根茎,含有微量的马兜铃酸I。研究[3-4]表明,马兜铃酸具有肾毒性作用,可引起急性马兜铃肾病、肾小管功能障碍性马兜铃肾病等。同时,跳骨片中细辛为直接粉碎后压片,占处方的2.34%,因此,建立灵敏度较高的测定马兜铃酸I限量检查方法,对保证跳骨片的质量及用药安全具有重要意义。本实验采用LC-MS/MS方法,大幅提高了分析效率[5],增加了定性的准确性,并确定了最低检测限度,为跳骨片安全评价提供依据。

1 仪器、试药及样品

1.1 仪器

高效液相色谱-三重四级杆质谱系统(美国AB公司),包括LC30A液相色谱系统,AB Qtrap 5500质谱仪,Analyst工作站;BP211D分析天平(赛多利斯公司),ME204分析天平(梅特勒公司),KQ-500DE型数控超声波清洗机。

1.2 试剂与材料

马兜铃酸I(批号:110746-201611),由中国食品药品检定研究院提供;水为超纯水,乙腈为色谱纯;其他试剂均为分析纯。

1.3 样品

11批跳骨片(批号:190210、190616、190618、190910、191005、200101、200104、200618、200810、201127、201201),由厂家提供或通过正规渠道购买获得。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Shim-pack Velox C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,2.7 μm);以乙腈为流动相A,0.1%甲酸为流动相B,按表1进行梯度洗脱;流速0.3 mL·min-1;柱温30 ℃;进样量:1 μL。[6]

表1 流动相梯度洗脱程序[7]

电喷雾离子源(ESI);正离子检测;电晕放电电流为3.0 A;离子源温度为 500 ℃;离子源气体 1(N2)压力为50 psi;气帘气体(N2)压力为 30 psi;扫描方式为多反应监测模式(MRM):扫描时间为100 ms,离子对及其他参数见表2[8-10]。

表2 马兜铃酸I质谱分析参数

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品储备液制备 精密称定马兜铃酸I对照品(批号:110746-201611)10.96 mg,至100 mL量瓶中,以70%甲醇作为溶剂,配制成浓度为109.6 μg·mL-1的溶液作为对照品储备液。

2.2.2 供试品溶液制备 取供试品适量,除去包衣,研细,取约2.2 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%甲醇25 mL,密塞,称定重量,超声处理(功率250 W,功率40 kHz)30 min,取出,放冷,再称定重量,用70%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,作为供试品溶液。

2.2.3 细辛药材溶液制备 取对应批次的细辛药材中粉适量,取约0.5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%甲醇25 mL,同供试品溶液方法制备,作为细辛药材溶液。

2.3 标准曲线与检出限

精密量取马兜铃酸I对照品储备液(浓度:109.6 μg·mL-1)1 mL,置于100 mL量瓶中,加70%甲醇定容至刻度,摇匀,作为线性中间溶液(浓度:1.096 μg·mL-1);分别精密量取线性中间溶液0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1 mL、2.5 mL、5 mL,各置50 mL量瓶中,用70%甲醇稀释至刻度,即得浓度分别为2.192 ng·mL-1、4.384 ng·mL-1、10.96 ng·mL-1、21.92 ng·ml-1、54.8 ng·mL-1、109.60 ng·mL-1的系列标准溶液,分别进样1 μL至质谱仪中,以峰面积为纵坐标,浓度为横坐标进行线性回归。

结果可得,马兜铃酸I进样量在2.192~109.60 ng·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系,回归方程:y=1 110.976 65x+ 1 504.134 77 (r=0.999 79)。

该方法最低检出量为2.192 pg(S/N=3),对应跳骨片供试品的检出限为22.7 ng·g-1。

2.4 精密度试验

精密吸取对照品溶液1 μL,连续重复进样6次,按上述条件测定保留时间及峰面积,结果RSD分别为0.30%与0.54%,说明该方法精密度良好。

2.5 回收率试验

取供试品(批号:200101,未检出马兜铃酸I未检出)适量,除去包衣,取约2.2 g,平行9份,置具塞锥形瓶中,分别精密加入马兜铃酸I对照品溶液(浓度:109.6 ng·mL-1)1 mL,(浓度:1.096 μg·mL-1)0.5 mL、1.5 mL,各3份,按供试品溶液制备方法同法制备,即得。由表3可得,该方法回收率良好。

表3 回收率考察

2.6 稳定性试验

精密吸取对照品溶液及回收率试验中4号加标供试品溶液,分别在0 h、3 h、6 h、10 h、14 h、18 h、24 h按上述方法,测定含量并记录,RSD为0.98%和1.06%。这说明对照品与供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 限度确定[11-12]

2020年版《中华人民共和国药典:一部》收载的细辛质量标准中,在其马兜铃酸I检查项下的限度为“细辛药材及饮片含马兜铃酸I不得过0.001%”;跳骨片处方中细辛用量为7 g,制成总量为300 g,经折算,初步拟定跳骨片中含马兜铃酸I不得过0.23 μg·g-1,见图1。

图1 马兜铃酸I的检出限、限度及样品图谱

2.8 样品含量测定

取11批次的跳骨片,按上述供试品处理方法制备、测定,见表4。

表4 11批样品测定结果

3 讨论

3.1 流动相的选择

本实验分别考察了乙腈-0.1%甲酸(35∶65),乙腈-0.1%甲酸(50∶50)[13],乙腈-0.1%甲酸(80∶20)等不同比例等度洗脱的流动相,除出峰时间差异较大外,峰型均有不同程度拖尾或扩散,故采用梯度洗脱并调整出峰时间。按文中流动相梯度洗脱,峰型有明显改善,保留时间合适,样品洗脱较完全,减少了对后续进样的干扰。

3.2 离子对选择

3.3 药材测定

本实验还分别考察了其中5批制剂对应投料的2批药材的含量,其马兜铃酸I含量分别为652 ng·g-1、534 ng·g-1,虽然低于药典要求限度,但仍有检出,且跳骨片制剂为药材原粉入药,更应对其制剂含量进行控制。

本实验建立的马兜铃酸I限量检查方法简便、快捷,灵敏度较高,对跳骨片的临床用药安全和质量控制具有重要的指导作用。同时,笔者认为,鉴于马兜铃酸对肾脏的伤害不可逆,且目前无针对性治疗方法,故应对仍在生产的处方含有细辛、关木通等马兜铃科植物的制剂品种,补充、制定马兜铃酸I的限量控制,并进一步寻找可替代成分,减少用量,以达到用药安全的目的。

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