基于指纹图谱技术与主成分分析优化苦参中苦参总碱的提取条件

鉴志刚，叶世芸*，殷少文，刘 巧，张艳琴

(1.贵州中医药大学，贵州 贵阳 550002；2.贵阳市第三人民医院，贵州 贵阳 550006；3.贵州得轩堂护康药业股份有限公司，贵州 贵阳 550008)

苦参总碱是中药苦参(Sophora flavescens)的提取物，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等功效[1]。近年来，除传统的渗漉法、萃取法[2]及回流法外，微波辅助法[3]、盐辅助法[4]、超声法[5]等新技术亦逐步应用于苦参总碱的提取纯化中。

由于中药“多组分”的特点，在中药质量评价过程中，检测单一成分或少数几种成分，难以有效评价中药质量的优劣[6]。而应用中药指纹图谱技术则可极大避免遗漏有效成分，可更加全面反映中药中化学成分的种类及含量，从而获取可有效代表中药化学成分的信息，现已成为国内外广泛接受的一种中药质量评价方式[7]。由于中药化学成分的多样性及复杂性，各组分权重系数较难确定，因而中药成分的综合分析难度较大。主成分分析法(Principal component analysis，PCA)是一种利用降低纬度思想，在少损失甚至不损失原有指标信息的基础上，把多个指标转化为少数几个相互独立指标的一种定量分析方法，运用主成分分析可通过少数几个综合指标反映原始指标的绝大部分信息，达到化繁为简的目的，指纹图谱技术结合主成分分析技术已应用于中药有效成分质量控制[8]、基源种类区别[9]及工艺参数的优化[10]等方面。

本实验采用正交实验设计法，以溶剂浓度、提取时间、提取次数、料液比为考察因素，比较乙醇回流法与乙醇超声法提取苦参总碱的效果差异。采用HPLC法建立苦参总碱粗提取物指纹图谱，并对其共有峰峰面积进行主成分分析，以主成分分析所得到的总因子得分为评价指标，优选苦参中苦参总碱的最佳提取条件，为苦参质量评价与苦参总碱最佳提取方法的筛选提供思路与依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪(型号：1260 HPLC；厂商：Agilent)；超声清洗仪(型号：YQ-1000A；厂商：上海易净超声波仪器有限公司)；药典筛(厂商：绍兴市上虞张兴沙筛厂)；高速多功能粉碎机(型号：HC-S4；厂商：永康市天琪盛世贸有限公司)；色谱柱(规格：4.6 mm×250 mm，5 μm；型号：Welch Ultimate XB-NH2)；电热鼓风干燥箱(型号：101-1A；生产厂商：天津天泰仪器有限公司)；万分之一天平(型号：AE240；生产厂商：上海梅特勒有限公司)；旋转蒸发器(型号：RE-2000B；生产厂商：上海亚荣生化仪器厂)；数显恒温水浴锅(型号：HH-4；生产厂商：常州普天仪器制造有限公司金坛市晶玻实验仪器厂)；永欣可控低温电炉(型号：TW-2000W；生产厂商：郫县永信电器厂)；高速离心机(型号：H2050R；生产厂商：湖南湘仪离心机仪器有限公司)。

1.2 试剂及药材

苦参采购于药材市场，经贵州中医药大学魏升华教授鉴定为豆科植物苦参(Sophora flavescens)的干燥根；苦参碱对照品(批号：110805-201709)；氧化苦参碱对照品(批号：110780-201909)；槐定碱对照品(批号：110784-201706)；槐果碱对照品(批号：110784-201405)；氧化槐果碱对照品(批号：111652-200301)均购于中国食品药品检定研究院，纯度均大于98%；乙腈、磷酸、无水乙醇为色谱纯，水为“哇哈哈”纯净水，95%乙醇、盐酸等其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱Welch Ultimate XB-NH2(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相乙腈-无水乙醇-3%磷酸(85∶7.5∶7.5)，柱温30 ℃，流速1.0 mL/min，检测波长220 nm，进样量10 μL[11]。

2.2 溶液配制

2.2.1 对照品溶液配制 取标准品氧化槐果碱、氧化苦参碱、苦参碱、槐定碱、槐果碱适量，精密称定，用乙腈-无水乙醇(85∶15)溶解定容。分别配制成含槐果碱 0.018 05 mg/mL、苦参碱 0.074 4 mg/mL、氧化苦参碱 0.318 0 mg/mL、槐定碱 0.149 6 mg/mL、氧化槐果碱 0.152 6 mg/mL的对照品储备液。

2.2.2 苦参总碱浸膏制备 称取苦参粉末32份，每份约10.0 g，采取乙醇回流、乙醇超声2种提取方式，按照表1中条件提取，提取液过滤后，弃去滤渣，浓缩提取液至最小体积，用1%HCl调节浓缩液pH 3～4后过滤，弃去滤渣，续滤液用10%NaOH调节pH 10～11。分别用滤液体积1倍、0.5倍、0.5倍、0.5倍的氯仿进行萃取，收集氯仿层并回收氯仿，95%乙醇溶解后，挥干溶剂，制得稠浸膏。精密称取浸膏0.6 g，5 mL无水乙醇溶解后，精密量取溶液1.0 mL至25 mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜滤过，备用。

表1 乙醇回流法、超声法设计因素与水平

2.4 指纹图谱方法学考察

2.4.1 精密度试验 取乙醇回流正交实验1号提取条件下供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图，计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD，结果显示，各共有峰相对保留时间的RSD为0.73%～1.32%，相对峰面积的RSD为0.88%～2.70%。这说明仪器精密度良好，符合指纹图谱要求。

2.4.2 稳定性试验 取乙醇回流正交实验1号提取条件下供试品溶液，分别于0、1、2、3、5、8 h按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图，计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD，结果显示，各共有峰相对保留时间的RSD为0.77%～1.88%，相对峰面积的RSD为0.47%～1.88%。结果表明，供试品在8 h内稳定性良好。

2.4.3 重复性试验 取乙醇回流正交实验1号提取条件下供试品溶液，重复制备6次，按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图，计算各共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD，结果显示，各共有峰相对保留时间的RSD为0.31%～1.16%，相对峰面积的RSD为1.79%～2.70%。结果表明，供试品制备方法重复性良好。

2.5 苦参HPLC指纹图谱的建立

取混合对照品溶液及“2.2.2”项下按正交实验表配制的供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定并记录色谱图，利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件进行分析，设定S1为参照色谱，对色谱峰进行多点校正及数据匹配，时间宽度为0.1 min，生成苦参HPLC指纹图谱叠加图。结果显示，在不同提取工艺产生的指纹图谱中，共确定12个共有峰，通过与混合对照品色谱图比对相对保留时间，可确定2号峰为槐果碱、4号峰为苦参碱、6号峰为氧化槐果碱、10号峰为槐定碱、11峰为氧化苦参碱。见图1、图2、图3、图4。

图1 混合对照品HPLC色谱

图 2 空白对照色谱

图3 乙醇回流法特征峰匹配图谱

图4 乙醇超声法特征峰匹配图谱

2.6 指纹图谱主成分分析

2.6.1 主成分提取及贡献率计算 采用SPSS 26.0统计软件对正交实验下不同提取方式的各组样品峰面积进行主成分分析法降维处理，提取特征值λ>1的特征根相应成分为主成分，获取可代表原始峰面积的主成分及相应贡献率，主成分总方差的解释见表2、表3，结果显示，两种不同提取方法下分别选取了3～4个主成分，累计方差贡献率分别为88.098%、90.647%，满足主成分累计方差贡献率达85%的要求，说明提取的主成分可以代表原始色谱峰峰面积的绝大部分信息。

表2 乙醇回流法主成分总方差解释

表3 乙醇超声法主成分总方差解释

2.6.2 综合评价[12]运用SPSS 26.0统计软件分别计算两种不同提取方式选取的各个主成分得分，即F1=主成分1的成分得分系数/初始特征值的算术平方根，以此类推分别算出各个主成分的得分，再根据特征向量推导出不同提取方式的主成分综合得分方程：F乙醇回流法=0.689 26F1+0.189 45F2+0.124 30F3，F乙醇超声法=0.672 94F1+0.121 33F2+0.106 19F3+0.099 55F4，按照公式分别计算不同提取条件下不同样品的综合得分。见表4。

表4 不同提取条件下PCA综合得分

2.7 正交实验工艺优化

本研究选取乙醇浓度(A)、提取时间(B)、提取次数(C)、液料比(D)等4个因素作为考察对象，以各个样品综合得分为评价指标，进行正交实验直观分析与方差分析，正交实验结果与直观分析结果见表5、表6，方差分析结果见表7、表8。

表5 乙醇回流法正交实验直观分析结果

表6 乙醇超声法正交试验直观分析结果

表7 乙醇回流法正交试验方差分析结果

表8 乙醇超声法正交试验方差分析结果

从正交实验直观分析结果看，两种提取方式下4种因素均对提取效果产生一定影响，乙醇回流提取条件下影响因素A>C>D>B，乙醇超声提取条件下影响因素C>D>B>A，从方差分析结果看，乙醇回流提取方式下A因素对提取效果影响最大，其次是C，再次为D，最小为B，而各个因素对提取效果均无显著影响，考虑到提取效率及生产成本，确定最优组合为A4B1C1D4(13倍90%乙醇，回流提取60 min，共提取1次)，乙醇超声提取方式下对提取效果影响最大的因素为C，其次为D、B，最小为A，而除了C因素外，其他因素对提取效果无明显作用，考虑到实际提取效率及生产成本，确定最优组合为A3B1C4D1(10倍85%乙醇，超声提取60 min，共提取4次)。两种提取方式相比，乙醇回流提取方式下药材长期处于加热状态下易导致苦参生物碱结构发生变化[13]，影响产出的苦参总碱质量，故综合考虑提取效率、生产成本、产品安全性等方面，采用乙醇超声条件下最优组合提取苦参总碱。

2.8 验证实验

取苦参粉末约10.0 g，精密称定，按上述正交实验优化的工艺平行制备6份，按“2.1”项下色谱条件进行测定，结果显示，各共有峰相对保留时间的RSD均小于1.2%，相对峰面积RSD均小于2.3%，且综合分析各共有峰面积得到6份样品的综合得分为2.6，表明实验稳定性好，得到的最佳提取工艺稳定、切实可行。

3 讨论

中药指纹图谱技术是一种整体、综合、可量化反映药物内部较多活性成分的定性、定量方法，其主要以色谱峰的相对保留时间及相对峰面积进行定性，以色谱峰面积进行半定量，近年来常用于中药质量评价与控制[14-18]。本研究选用L16(44)正交实验，建立乙醇超声法、乙醇回流法两种提取条件下苦参指纹图谱，分别确定了12、12个共有峰，利用SPSS 26.0统计软件对共有峰峰面积进行了主成分分析法降维分析，分别确定了4、3个可代表原始共有峰信息的主成分，以其综合得分为评价指标进行正交实验直观分析与方差分析，比较两种提取方法分析结果，优选出苦参最佳提取工艺参数，得出供试品提取时使用10倍 85%乙醇超声提取4次，60 min/次的提取优化方案，为苦参总碱最佳提取方法的筛选提供了思路与依据，但受制于实验规模及相关技术条件，实验室g级样品优选的最佳提取工艺在中试中是否还应保持一致仍需深入研究。

溶剂提取法是苦参中苦参总碱提取的常用基本方法，其操作简单，成本低，适于工业化生产，超声辅助提取技术可使药物细胞壁破裂，加速有效成分溶出，提高提取效率，缩短提取时间，在苦参总碱提取中发展前景良好[19]。2015年版《中华人民共和国药典》中采用氯仿作为溶媒，超声法提取苦参碱，具有较好的提取效果[11]，但考虑到氯仿对人体心、肝、肾等器官有一定损害，具有一定危险性，故本研究采用安全性较高的乙醇作为溶剂，减少苦参总碱分离纯化过程中可能产生的有毒溶剂残留，提高了实验安全性。通过对色谱条件的考察，进行全波长扫描[20]，结果显示，在220 nm时吸收最大，检出峰各峰比例合适，基线较平稳，可基本反映出苦参中苦参总碱的整体面貌，故选择以220 nm作为检测波长。

本研究建立了苦参生物碱指纹图谱，采用HPLC法以主成分分析得到的总因子得分为评价指标，而有研究者对苦参提取工艺进行优化时选用滴定法测定苦参总碱的含量，以苦参总碱含量为指标进行提取工艺优化，但滴定法专属性不强，滴定终点的判断易受主观因素影响，人为误差较大，影响实验结果的准确性[21]。HPLC法准确度好，专属性强，不易受杂质干扰，可全面覆盖苦参中大部分有效成分，全面性与综合性强，可更好地控制苦参总碱的质量与提取效果。

本研究将指纹图谱技术与化学计量法相结合用于中药苦参提取工艺优化，全面考察了药材提取状况的同时又简化了数据，便于分析，具有一定的实用性与适用性。