高致病性猪蓝耳病与猪圆环病毒2型混合感染的诊断

李 博，陈中元，王京仁，王贵平

（1.湖南农业大学动物医学院，湖南 长沙 410128；2.常德市农业大分子研究中心，湖南文理学院生命与环境科学学院，湖南 常德 415000）

1 发病情况

据场负责人反映，该场存栏经产母猪400头，肥育猪600头，在2020年11月断奶仔猪转保育舍时，发现有仔猪腹泻，并陆续出现死亡，且病死率比较高。仔猪死亡前耳朵发紫，同舍猪也陆续出现死亡。

2 临床症状

送检的4头仔猪体温在39～41 ℃，被毛粗乱，消瘦，眼睑肿胀，精神沉郁；其中有两只的耳部、背部、腹下发绀明显，并且皮肤有出血斑点，后躯无力，四肢划动，呼吸困难。在解剖前有2头已经死亡。

3 病理变化

将送检的4头仔猪在指定的隔离区进行解剖并详细记录剖检变化。经剖检发现，4头仔猪腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结肿大，有心包积水，肺出血，呈间质性肺炎；肾脏表面有出血点且被膜易剥离；脾脏肿大，肝脏出现白色结节、肿大。

4 实验室诊断

4.1 材料

4.1.1 样品处理 采集病猪的肾脏、淋巴结、肺等组织，取约1 g左右放入研磨管，加入适量生理盐水，进行充分研磨，研磨成匀浆后，移入1.5 mL离心管，4 ℃ 10 000 r/min，离心5 min，取上清液0.2 mL待用。

4.1.2 主要设备和试剂 主要检测仪器：美国BIO-RAD公司荧光定量PCR仪、德国Biometra梯度PCR仪检测实验室室温25 ℃（表1）。

表1 主要试剂及厂家

4.2 诊断方法

4.2.1 猪蓝耳病病毒实时荧光PCR检测 参照病毒核酸提取试剂盒说明书，提取组织样品中猪蓝耳病病毒RNA；按照猪蓝耳病病毒实时荧光PCR检测试剂盒说明书配制反应体系。反应条件如下：50 ℃ 30 min，95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，25 ℃ 10 s（40个循环）。

4.2.2 猪圆环病毒2型实时荧光PCR检测 参照病毒核酸提试剂盒说明书，提取组织样品中猪圆环病毒2型DNA；按照猪圆环病毒2型实时荧光PCR检测试剂盒说明书配制反应体系。反应条件如下：50 ℃ 2 min，95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，25 ℃ 10 s（35个循环）。

4.2.3 猪蓝耳病病毒阳性样品RNA逆转录 若对猪蓝耳病病毒检测出现阳性，参照BioRT Master逆转录扩增（RT-PCR）试剂盒说明书配制反应体系。反应条件如下：50 ℃ 30 min，94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，72 ℃ 5 min（35个循环）。

4.2.4 猪蓝耳病病毒阳性样品测序 对猪蓝耳病病毒阳性样品进行测序，并与不同蓝耳病毒株进行序列比对。

5 结果

5.1 荧光定量PCR检测结果

经荧光定量PCR检测。4份样品中，猪蓝耳病病毒阳性样品3份，1份样品为可疑结果，猪圆环病毒2型阳性样品4份。

5.2 猪蓝耳病病毒阳性样品测序

用测序引物对1号、2号、3号、4号样品进行RT-PCR扩增，反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果1号、2号、3号阳性样品出现目的条带，4号可疑样品没有出现目的条带，4份PCR扩增结果详见图1。将3个猪蓝耳病病毒检测阳性样品的目的条带切下，并分别装入离心管中做好标记，送往湖南擎科生物科技有限公司进行测序。

图1 4份猪蓝耳病病毒样品PCR扩增结果

5.3 猪蓝耳病病毒基因遗传进化分析

将3个蓝耳病阳性样品的基因与基因库中蓝耳病病毒毒株进行遗传进化关系对比。结果如图2，1号、2号、3号在同一个大分支上。1号、2号、3号与15HUN3、JXA1-P160等高致病性毒株在同一个大分支上。说明它们的亲缘关系较近。1号、2号、3号与CH-1R、NADC30、CH-1a等低致病性毒株不在同一分支上，说明它们的亲缘关系较远。

图2 猪蓝耳病病毒株基因序列遗传进化树

5.4 猪蓝耳病病毒同源性序列分析

从同源性序列对比图3中可以看出，1号样品与HUN4的相似度最高，为98.9%；2号样品与HUN4的相似度最高，为99.6%；3号样品与JXA1-P160的相似度最高，为100%。

图3 猪蓝耳病病毒株同源性序列对比

5.5 结论

根据序列分析得出的结果可知，3个蓝耳病阳性分离株与高致病性毒株的同源性最高，推测这3个蓝耳病阳性分离株为高致病性毒株。并参考临床症状和解剖病变诊断，该猪场暴发的病情为高致病性猪蓝耳病和猪圆环病毒2型混合感染。

6 讨论

通过同源性序列对比图可知1号、2号样品与HUN4的相似度最高，而3号样品与JXA1-P160的相似度为100%。说明该猪场已经存在高致病性猪蓝耳病病毒的流行。应该对猪群进行紧急接种，并对全场实行封闭管理，进出的车辆进行严格的消毒。对圈舍定期清理，通过通风、换气等措施提高空气质量。禁用变质的饲料，适量的饲喂青绿饲料，做到营养均衡[1]。定期进行水质测试，确保为猪提供清洁的水源[2]。对发病猪舍进行彻底消毒，对病死猪进行无害化处理，空栏7～10 d再进猪。必须隔离和观察新引进的种猪，采取免疫措施，并对所在猪舍进行严格消毒[3]。

本次实验室检测的4份样品中，高致病性猪蓝耳病与猪圆环病毒2型的混合感染率为75%。近年来，随着猪场集约规模化发展，养殖密度也越来越大，病毒病以及多种病毒病混合感染的发生率也越来越大[4]，其中最常见的就是猪蓝耳病与猪圆环病的混合感染[5]。猪蓝耳病是一种传染性很高，致病力很高的传染病。它的传播途径有很多种，如空气，猪群间等，对养猪业有很大的影响[6]。猪圆环病毒2型可侵害猪的神经、呼吸、消化等系统，使机体发生综合性衰竭，该病在仔猪中发病率高达50%，致死率为20%[7]。养猪场须解决当前在猪常见传染病免疫工作中的缺陷，严格按照国家要求采取有力措施，有效做好猪疫病的免疫、预防和控制，并尽可能防止猪病的发生。