北疆某规模化养猪场猪圆环病毒2型抗体及抗原检测与分析

常军帅，程露露，张 琪，屈勇刚，梁 晏，李 娜，孙琼飞，王紫阳

（1.石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832003；2.动物疾病防控兵团重点实验室，新疆 石河子 832003）

猪圆环病毒（Porcine circovirus, PCV)为最小的环状ssDNA病毒之一，因与其他病毒区别较大，在分类上将其归属为圆环病毒科、圆环病毒属。PCV可分为4种不同的类型，分别为PCV1（圆环病毒1型）、PCV2（圆环病毒2型）、PCV3（圆环病毒3型）和PCV4（圆环病毒4型）。PCV1于1974年被德国科学家Tischer在猪肾细胞内首次发现，是一种不引起细胞病变（CPE）的病毒[1]；1991年，加拿大科学家Ellis等[2]从断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）病猪群内分离出了一株新型病毒，具有极强的致病性，因与之前发现的PCV1病毒类似，所以后来被命名为PCV2；PCV3、PCV4分别于2017年、2019年被先后发现并报道[3]。PCV2生存能力极强，在75 ℃下也可坚持15 min不被杀灭，且具有极强的致病性，会对各个不同阶段的猪群产生不良影响，在种猪群可导致母猪体内带毒/公猪精液带毒，生产中常引起母猪久配不孕、反复发情；在妊娠后期，会影响胎儿生长，降低仔猪初生重；对于6周龄前的仔猪，PCV2通过免疫抑制，可引起PMWS、“抖抖病”（CT）、猪皮炎肾病综合征（PDNS），也可使猪群继发猪细小病毒病（PPV）和猪蓝耳病（PRRS）；对于肥育猪，感染PCV2后表现为亚健康，饲料利用率降低，经济损失最为严重[3]。PCV2为病毒性疾病，目前只能依靠疫苗免疫来预防此病，然而由于种猪带毒、免疫程序不合理或疫苗质量较差，导致在生产操作中免疫效果较差，需采用一定检测技术对免疫效果及猪群是否存在PCV2感染进行评价。

为了解北疆某规模化养猪场PCV2免疫猪群[疫苗及免疫程序均按照《国家中长期动物疫病防控规划（2012—2020）》中农业部制定的常见动物疫病免疫的推荐方案]的PCV2的抗体水平及病原存在情况，本试验于2019—2020年在该场采集了671份血清样品，进行了PCV2抗原抗体检测与分析，以期为该场PCV2的免疫防控提供帮助。

1 材料

1.1 样品

2019年1月至2020年12月期间从北疆某规模化养猪场，共采集671份血清样品，送至石河子大学动物科技学院传染病实验室进行检测。其中哺乳仔猪130份、保育猪113份、肥育猪148份、后备猪73份、种公猪39份、经产母猪168份。

1.2 材料和仪器

诊断试剂盒（批号：PCV20200518E）为猪圆环病毒2型（PCV2）ELISA（酶联免疫吸附试验）抗体检测试剂盒，购自哈尔滨元亨生物药业有限公司；兽用一次性采血器5 mL为美康实业有限公司产品；PCR仪、自动酶标仪、微量移液器购自赛默飞世尔科技公司；DL 2 000 DNA Marker、病毒基因DNA/RNA提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。

2 方法

2.1 样品处理

根据猪群不同，从耳缘静脉或前腔静脉采集3～5 mL血液，室温下静置析出清亮、无溶血的血清，收集至EP管直接检测。

2.2 间接ELISA检测

2.2.1 方法 根据猪PCV2的ELISA抗体检测试剂盒说明书进行操作，试验前把试剂恢复到（25±3） ℃（抗原包被板仍4 ℃保存）。先将已作5倍稀释（20 μL血清样品加入80 μL的样品稀释液）的血清样品100 μL、100 μL阴性和阳性对照（各2孔）加入抗原包被孔内，轻微震荡后加盖封口膜，置37 ℃电热恒温培养箱孵育30 min。孵育后洗涤5次，每孔加入100 μL酶结合物液，再次孵育30 min，然后洗涤5次。加入100 μL的底物液（底物液A与底物液B等体积混合）在37 ℃条件下避光显色15 min后，加入50 μL终止液使反应终止，用酶标仪于450 nm处测定OD值用来分析。

2.2.2 结果判定 试验成立的条件是阴性对照的OD450均值≤0.15，阳性对照OD450均值≥0.60。若不符合，需再次进行试验。

临界值=阳性对照OD450均值×1/4。被检样品OD450值＜临界值，判定为抗体阴性；被检样品OD450值≥临界值，则判定为抗体阳性。

2.2.3 数据分析 使用SPSS软件统计分析PCV2抗体的S/P平均值、阳性率及各猪群间的差异。

2.3 PCV2抗原检测

按照病毒基因DNA/RNA提取试剂盒说明书对PCV2抗体阳性值数据过高的血液混样提取核酸，然后用PCR扩增。引物序列参考文献[4]，由北京睿博兴科生物技术有限公司合成PCV2特异性引物，引物序列为：F：5'-CTGTTTTCGAACGCAGTGCC-3'；R：5'-GCATCTTCAACACCCGCCT-3'。PCR反应体系的设计（20 μL）：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，设置为35个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。反应结束后取7 μL进行1%的琼脂糖电泳，预期产物大小为486 bp。

3 结果

3.1 各类别猪群PCV2抗体检测结果

在各类别猪群中，哺乳仔猪群和保育猪群抗体阳性率较低，分别为38.46%（50/130）和29.20%（33/113）；经产母猪群、后备猪群、肥育猪群、种公猪群抗体阳性率依次为83.93%（141/168）、75.34%（55/73）、72.30%（107/148）和76.92%（30/39）。不同猪群之间PCV2平均抗体水平存在差异，保育猪群和经产母猪群、后备猪群、肥育猪群、种公猪群差异显著（P＜0.05）；种公猪群和后备猪群、肥育猪群差异不显著（P＞0.05）。结果见表1。

表1 不同类别群猪PCV2免疫抗体检测结果

3.2 各类别猪群PCV2抗原检测结果

通过对抗体阳性数据过高的猪只进行PCV2抗原检测，发现各猪群内均存在PCV2抗原。结果见图1。

图1 不同类别群猪PCV2抗原PCR检测结果

4 讨论与分析

猪圆环病毒病为免疫抑制性疾病，可引起猪群免疫力低下、疫苗免疫效果差，继而引发蓝耳病、细小病毒病等，给养猪业造成严重的损失。通过本次对该规模化养猪场的671份血清进行PCV2抗体检测，发现该猪场PCV2抗体阳性率为62.00%（416/671），低于国家规定的水平（70.00%）。在各类猪群中，哺乳仔猪群和保育猪群抗体阳性率较低，分别为38.46%（50/130）和29.20%（33/113），说明PCV2的疫苗免疫程序存在改进空间。该猪场PCV2的疫苗首次免疫时间为仔猪出生后的第4周龄，在未免疫前仔猪就有38.46%（50/130）呈现出抗体阳性，与杨渗等[5]所检测出的哺乳仔猪群45%（36/80）抗体阳性率结果相比较低，推测原因可能是母源抗体的存在较少，可加强对妊娠母猪的PCV2免疫次数。保育猪群的抗体阳性率均值在各猪群内最低，为29.20%（33/133）。庄汝柏等[6]研究发现随着仔猪日龄的增长，PCV2的母源抗体水平将不断下降，可以通过进一步对母源抗体水平的测定，并结合PCV2疫苗的抗体产生效果，规划出最适合PCV2首免日期，便可提高保育猪群对PCV2的抗体阳性率。经产母猪、后备猪、肥育猪、种公猪的PCV2抗体水平均超过了国家规定的水平（70.00%），但均低于杨渗等[5]所检测出的抗体水平。肥育猪的抗体水平为72.30%（107/148），说明部分猪未免疫成功。肥育猪体型较大，在免疫过程中经常会出现“飞针”现象，可采用更易固定猪只的设备，保证免疫质量，防止猪群免疫力低下造成的料重比增高。经产母猪、后备猪和种公猪都属于种猪群，种猪的免疫程度对猪场健康发展起到了决定性的作用。建议加强免疫次数或更换更好的疫苗，进而提高猪场对PCV2的抵抗力。

通过对各猪群抗体检测数据异常的猪只血清混样后进行抗原检测，发现不同类别的猪群都存在PCV2的感染。徐丽华等[7]曾对猪场进行过PCV2抗原检测，阳性率检出结果为27.4%（90/329），证明了猪群中普遍存在着PCV2的感染情况。哺乳仔猪、保育猪的PCV2抗体水平低于其他场或地区，而且在抗体阳性中还有部分是由于抗原感染造成的抗体阳性，说明该场的PCV2疫苗免疫情况比我们看到的更差。对于种猪群，尤其是种公猪群，也存在着PCV2感染情况，会导致整个猪场各个猪群相继感染PCV2。针对这种情况，我们可对种猪逐个排查，进行单个猪只样品的检测，发现阳性猪只立马淘汰，同时对其生活圈舍彻底消毒。通过净化种猪群，才可在整个猪场的PCV2净化中看到效果。

PCV2本身并不可怕，但通过降低猪群免疫力，提高了死亡率。只有净化种猪群，并对各个阶段的猪群加强PCV2免疫，完善免疫程序，才可为猪场创造更高的经济效益。