HPLC法快速测定保健食品中14种非法添加物

彭小东，李红洲，谈晓君，肖超，曹天顺

贵州省产品质量检验检测院（贵阳 550014）

随着社会发展，工作、生活节奏加快，压力变大，失眠多梦、焦虑不安正成为困扰人们的常见问题[1]。因此，纯植物或纯中药成分的安神类健康产品受到消费者欢迎，随着市场的不断扩大，一些不法分子利用西药成分（化学成分）见效快、功能强的特点，将其添加至保健食品中，以此夸大产品的功效，提高产品销量，谋取非法利益。临床常用的巴比妥等镇静药物，虽具有较强的镇静催眠作用，但长期服用，会使人产生不良反应甚至是毒副作用。这种不法行为严重危害消费者的身体健康，同时也对保健食品的声誉产生不良影响，阻碍保健食品行业的健康发展[2-4]。

国家食品药品监督管理局出台的补充检验方法和检验项目的批准件[5]及相关文献报道中，针对保健食品中非法添加化学成分的检测方法主要有理化分析[6]、薄层色谱法[7-8]、高效液相色谱法[9-11]、气质联用法[12-13]及液质联用法[14-18]等，其中，高效液相色谱法因其分析速度快、灵敏度高等特点，是目前最常用的检测方法。此外，通过查阅相关文献，目前有关安神类中成药和保健食品中的非法添加物的筛查方法报道较少，存在分析时间过长、检测成分不多等问题。因此，试验以14种非法添加物（巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥、司可巴比妥、氯硝西泮、马来酸咪达唑仑、硝西泮、艾司唑仑、阿普唑仑、三唑仑、奥沙西泮、劳拉西泮、地西泮和氯氮卓）为研究对象，采用高效液相色谱法，建立一种同时测定安神类保健品中14种非法添加的化学成分快速检测方法，为政府部门加强食品质量监管提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氯氮卓（CAS 58-25-3）、马来酸咪达唑仑（CAS 59467-94-6）、硝西泮（CAS：146-22-5）、艾司唑仑（CAS 29975-16-4）、奥沙西泮（CAS 604-75-1）、阿普唑仑（CAS 28981-97-7）、劳拉西泮（CAS 846-49-1）、氯硝西泮（CAS 1622-61-3）、三唑仑（CAS 28911-01-5）、地西泮（CAS 439-14-5）、苯巴比妥（CAS 50-06-6）、司可巴比妥（CAS 76-73-3）、异戊巴比妥（CAS 57-43-2）标准品：SIGMA-ALDRICH公司，标准品均为液体，质量浓度1.0 mg/mL，纯度大于98.0%；巴比妥（CAS 57-44-3）：International Laboratory USA，固体，纯度大于98.0%。

色谱柱，Agilent Poroshell 120 EC-C18柱（100 mm×4.6 mm×2.7 μm，美国安捷伦公司）。

模拟阳性样品（取褪黑素维生素B6胶囊，加入适量上述14种标准品，充分混匀，静置过夜后，作为模拟阳性样品）。

甲醇、乙腈色谱纯（德国Merck公司）；乙酸、甲醇分析纯（国药集团）；试验用水为经超纯水仪（英国ELGA）处理的一级水。

1.2 仪器与设备

Aglient 1260 II高效液相色谱仪（配DAD检测器，美国安捷伦公司）；冷冻离心机（美国贝克曼库尔特公司）；电子天平（梅特勒，感量0.0001 g）；旋转蒸发仪（东京理化器械株式会社）；混匀振荡器（Heidolph公司）；移液器（德国普兰德公司）。

1.3 试验方法

准确称取0.0100 g巴比妥固体标准品于10 mL容量瓶中，加入色谱甲醇溶解后，定容至刻度，制得1.0 mg/mL巴比妥标准储备液；准确移取0.25 mL 14种标准品溶液（质量浓度1.0 mg/mL）于5 mL容量瓶中，用色谱甲醇定容至刻度，摇匀，配制成50 μg/mL混合标准储备液，于-20 ℃贮藏。临用前，用色谱甲醇配制成相应浓度的标准工作液，于4 ℃贮藏。

1.3.2 色谱条件优化

流动相条件：参考国家食品药品监督管理局药品补充检验方法和检验项目批准件及相关文献[5-6]的流动相体系，并对其进行优化，进样量5 μL，流速2.0 mL/min。

检测波长选择：采用紫外检测器，全波长扫描，光谱波长范围190～400 nm。

1.3.3 方法学考察

1.3.3.1 检出限、定量限及线性关系的考察

取50 μg/mL的14种非法添加物的混合标准溶液贮备液，用甲醇稀释成浓度梯度2，5，10，20和50 μg/mL的标准工作液，以各组分的质量浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，进行回归分析，绘制标准曲线；以3倍基线噪声（3）所对应的浓度作为测定方法的检出限（SLOD）浓度、10倍基线噪声（S/N=10）对应的浓度作为定量限（SLOQ）浓度，计算14种非法添加物的检出限和定量限。

11 刘译：...and that their understanding of the Way is similar.[4]38

1.3.3.2 精密度和稳定性

取6个平行空白样品（未检出上述非法化学添加物），加入14种混合标准品溶液，使每个空白样品最终加标浓度为10 mg/kg，按照1.3.4的方法进行前处理，上机，测定峰面积和保留时间，并在0，2，4，8和24 h各进样1次，记录不同时间点14种非法添加物的峰面积，计算相对标准偏差（SRSD）。

1.3.3.3 方法回收率

取某镇静安神类胶囊（阴性样品），并向其中添加低、中、高3个水平浓度的14种非法化学添加物的混合标准溶液，每组3个平行，计算各成分的回收率。

1.3.3.4 专属性试验

取模拟阳性样品及褪黑素维生素B6胶囊（空白样），按照试验方法进行提取、上机分析，考察其专属性。

1.3.4 样品浓度的测定

片剂、丸剂等大颗粒固体样品粉碎后混匀，胶囊取内容物，准确称取5.00 g供试样品于150 mL鸡心瓶中，加约30 mL三氯甲烷，超声处理20 min，放至室温，减压浓缩至近干，准确加入5 mL色谱甲醇，涡旋溶解后，过0.22 μm有机膜，待上机。

2 结果与分析

2.1 流动相的优化

流动相采用等度洗脱方法，分析时间过长，不利于常规分析，国家食品药品监督管理局药品补充检验方法和检验项目批准件（编号2009024）中的液相方法采用的就是等度洗脱法，14种化合物的分析时间大于60 min；采用乙腈（B）-体积分数0.2%乙酸（A）的流动相体系，进行梯度洗脱（见表1），在此梯度程序下，各组分的峰形较好，分离度符合分析要求，分析时间短（15 min），这也可能是与使用粒径更小的色谱柱有关，使得各组分得到更好的分离效果，并且乙酸溶液可促进电离，提高离子化效率，有利于后期进行质谱分析方法的开发，因此确定采用该流动相体系。

表1 梯度洗脱程序

2.2 检测波长的选择

通过全波长扫描，结果发现在210 nm处为巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥、司可巴比妥、氯硝西泮的最大吸收波长，220 nm处为马来酸咪达唑仑、硝西泮、艾司唑仑、阿普唑仑、三唑仑的最大吸收波长，230 nm处为奥沙西泮、劳拉西泮、地西泮的最大吸收波长，246 nm处为氯氮卓的最大吸收波长，比较14种化合物在上述几个波长的检测灵敏度后，综合考虑检测灵敏度及效率值（无需切换波长），方便定量，选用210 nm波长作为14种化合物的检测波长。

2.3 检出限、定量限及线性关系的考察

采用1.3.3.1的方法对该方法的检出限、定量限及线性关系进行考察，结果如表2所示。

由表2可以看出，在2～50 μg/mL范围内，14种非法添加物的线性关系良好，线性相关系数（r）均大于0.9990，方法的检出限为0.06～0.6 mg/kg，定量限为0.2～1.8 mg/kg，说明该试验方法灵敏度好，准确度高。

表2 14种非法添加物质的线性关系、检出限和定量限

2.4 精密度和稳定性试验

精密度和稳定性：按照1.3.3.2方法进行处理和计算，结果见表3。

表3 14种非法添加物的精密度和稳定性

由表3可知，6个平行样品中14种非法添加物的峰面积SRSD为0.12%～0.37%，保留时间的SRSD为0.10%～ 0.29%，各组分的峰面积及保留时间无明显变化，说明试验方法的精密度良好；24 h内14种非法添加物的峰面积的SRSD为0.11%～4.10%，峰面积大小无明显变化，说明14种非法添加物在24 h内的稳定性良好。综上所述，试验方法重现性好，相对稳定，可用于保健食品中14种非法添加物的检测。

2.5 回收率试验

为考察试验方法的准确性和可行性，试验选取某镇静安神类胶囊（阴性样品），并向其中添加低、中、高（2.0，4.0和8.0 mg/kg）3个水平浓度的14种非法化学添加物的混合标准溶液，每组3个平行，计算各成分的回收率及SRSD，结果见表4，各成分的平均回收率为80.0%～101.5%，SRSD＜10%，进一步说明试验所建立的方法准确度高、精密度好，满足多种非法添加物分析的要求。

表4 14种非法化学添加物质的回收率试验结果（n=3）

2.6 专属性试验

取模拟阳性样品及褪黑素维生素B6胶囊（空白样，图2），按照试验方法进行提取、上机分析，色谱图见图2～图4（波长均为210 nm）。在与14种混合标准溶液（图1）相同的保留时间处，模拟样品（图3）均检出光谱特征一致的色谱峰，说明试验方法可以很好地排除保健食品中其他组分的干扰，方法专属性良好。

图1 10 μg/mL标准品HPLC色谱图

图2 褪黑素维生素B6胶囊HPLC色谱图

图3 模拟阳性样品HPLC色谱图

3 结论

试验利用高效液相色谱分析技术，建立一种同时检测安神类保健食品中14种非法添加物的方法，与发布的药品补充检验方法[5]相比，试验方法对各非法添加物的分析进行整合，缩短分析时间，提高分析效率，且该方法的灵敏度高、选择性强、准确度高，可应用到安神类保健食品中非法添加物的快速筛查，有利于提高基层药检机构在打击安神类保健食品中非法添加化学成分的工作效率。但试验采用的高效液相色谱法在对基质复杂的样品进行分析时，会遇到假阳性的干扰，因此后续应进一步结合质谱分析，建立高效液相色谱-串联质谱的分析方法，进行更为准确的定性、定量检测。