藤茶总黄酮通过调控TGF-β1/p38MAPK通路对肝纤维化大鼠的作用及机制研究

李 雯，李木松，王利兵

（1.邯郸市第三医院药剂科，河北 邯郸 056000；2.保定市人民医院肝五科，河北 保定 071000；3.唐山市工人医院肝胆外科，河北 唐山 063000）

肝纤维化是各种肝病向肝硬化发展的必经步骤，是影响慢性肝病预后的重要因素。随着全世界慢性肝病患者的增加，肝纤维化的防治尤为重要，寻找有效抑制肝纤维化的药物也日渐紧迫[1]。近年来，西药治疗肝纤维的局限性逐渐显现，中药研究逐渐被重视。中医认为[2]，肝纤维化病机为正虚血瘀，正虚为肝肾阴虚与脾肾阳虚，血瘀为瘀阻肝络，因此辨证论治，解毒通络是主要治疗思路。藤茶总黄酮（TF）是从藤茶中提取的有效成分，藤茶是民间常用的治疗感冒发热、咽喉肿痛、肝炎肝硬化等疾病的药物。有研究表明[3]，藤茶总黄酮具有消炎抑菌、降血脂、止咳化痰、抗氧化和保肝护肝等功效，但藤茶总黄酮在体内通路的作用机制尚不明确。研究表明[4]转化生长因子β1/p38-促分裂原活化蛋白激酶（TGF-β1/p38MAPK）通路在形成肝纤维化过程中起到重要作用，因此本研究通过皮下注射四氯化碳（CCl4）构建大鼠肝纤维化模型，口服灌胃观察藤茶总黄酮对大鼠肝纤维化的作用，通过TGF-β1/p38MAPK 通路阐述藤茶总黄酮修复肝纤维化的作用机制，为肝纤维化治疗提供更多思路和可能性。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF 级Wistar 大鼠，雄性65 只，6 周龄，体质量190～230 g，12 h 照明，自由进食饮水，购自常州卡文斯实验动物有限公司，许可证号SCXK（苏）2016-0010。藤茶总黄酮含量47.52%（宝鸡晨光生物科技有限公司，生产批号：20190306），金龙鱼花生油（保定沃尔玛超市，生产批号：20151029），激动剂（anisomycin）（德国Merck 公司，10 mg/支），四氯化碳（CCl4，广东西陇化工，生产批号：20150511），I 型胶原蛋白（Col Ⅰ）试剂盒、III 型胶原蛋白（Col Ⅲ）试 剂 盒（美 国R&D 公 司），兔 抗 鼠TGF-β1、p38MAPK、α 平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、小鼠抗大鼠β-actin 抗体（美国Abcam 公司），一抗、2× SYBR Green 荧光染料（美国Roche 公司），反转录试剂盒（日本Takara 公司），BCA蛋白定量试剂盒、ECL显影液（美国Bio-rad公司），HE 染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）全自动生化分析仪（山东博科生物公司），RM2535 切片机（日本Leica 公司），CX40 显微镜（日本Olympus 公司），水平电泳仪、垂直电泳仪、CheniDoc Touch 成像分析系统、CFX Connect 实时荧光定量PCR 仪（美国Biorad 公司），Epoch 酶标仪（德国Bioeck 公司）。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 对照组（背部皮下注射花生油加灌胃生理盐水）、模型组（背部皮下注射25% CCl4加灌胃生理盐水）、藤茶总黄酮低剂量组（背部皮下注射25% CCl4加灌胃75 mg/kg 藤茶总黄酮）、藤茶总黄酮高剂量组（背部皮下注射25% CCl4加灌胃300 mg/kg 藤茶总黄酮）、激动剂组（背部皮下注射25% CCl4加灌胃300 mg/kg 藤茶总黄酮加腹腔注射2 mg/kg anisomycin）。

1.2.2 模型[5]制备及给药方法 模型组、藤茶总黄酮低剂量组、藤茶总黄酮高剂量组、激动剂组大鼠皮下注射25% CCl4（CCl4与花生油1:3 混合）2 mL/kg，每3 d 注射1 次，连续10 周；对照组背部皮下注射花生油2 mL/kg，每3 天注射1 次，连续10 周；对照组和模型组第6 周开始生理盐水灌胃6.3 mL/kg，每天1 次，至第10 周结束；藤茶总黄酮低剂量组、高剂量组分别于第6 周开始灌胃75、300 mg/kg 藤茶总黄酮，至第10 周结束；激动剂组第6 周开始灌胃300 mg/kg 藤茶总黄酮后，腹腔注射anisomycin 2 mg/kg，至第10周结束。

1.2.3 标本收集 第10 周最后一次给药2 h 后眼底静脉丛取血2 mL，室温静置30 min，3 000 r/min 离心15 min，分离血清，置于-80 ℃保存，用于检测各项血清指标。各组大鼠颈椎脱臼处死后，分离肝组织，生理盐水清洗后留取左叶，10%中性甲醛固定48 h，用于HE 染色。另取部分肝脏组织于-80 ℃保存备用。

1.2.4 血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）检测 采用全自动生化分析仪测定血清中ALT、AST 含量，在损伤肝脏中，ALT、AST 水平会明显增加，以此作为判断肝功能损伤的相关指标。

1.2.5 肝组织病理学染色 各组肝组织10%甲醛固定48 h 后，流水冲洗1 h，乙醇梯度脱水后，石蜡包埋，5 μm 连续切片，石蜡切片置于烘箱中60 ℃烤片2 h，脱水后苏木精染色5 min，自来水冲洗15 min，伊红复染2 min，无水乙醇脱水，二甲苯透明后重型树胶封片，经显微镜观察各组肝组织纤维化改变。

1.2.6 肝组织中Col Ⅰ、Col Ⅲ检测 取-80 ℃保存肝组织，按照1:9 质量比加入PBS，匀浆取上清液，采用ELISA 法检测肝脏中Col Ⅰ、Col Ⅲ，严格按照试剂盒说明书操作，最后通过酶标仪测定吸光度，根据标准曲线计算Col Ⅰ、Col Ⅲ含量。

1.2.7 肝组织TGF-β1、p38MAPK、α-SMA、MMP-9 mRNA 表达检测取-80 ℃保存肝组织，通过Trizol法提取总RNA，测定RNA 含量后，通过反转录试剂盒逆转录成稳定的cDNA，逆转录体系：RNA 5 μL，dT18 1 μL，RNAase free 水 7 μL。荧光定量PCR 反应按照试剂盒反应体系：SYBR Premix Ex Taq 13 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，cDNA 3 μL，ddH2O 10 μL。荧光定量反应条件：98 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，重复35 个循环。以β-actin 为内参，通过2-△△CT法计算TGF-β1、p38MAPK、α-SMA、MMP-9 的相对表达量，上下游引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.8 TGF-β1、p38MAPK、p-p38MAPK、α-SMA、MMP-9 蛋白表达检测 取约100 mg 肝组织，加入1 mL 裂解液，研磨后匀浆，放入离心管，置于冰上，10 000 r/min 离心20 min，取上清采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法测定蛋白含量。取40 μL 蛋白样品加入10 μL5×上样缓冲液，95 ℃水浴5 min，冻存于-20 ℃，用于进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）分离。分离胶与浓缩胶配置完成后，120 V 60 min 完成电泳，半干转印条件22 V 30 min，取出NC 膜，脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗（1:1 000 稀释）4 ℃摇床过夜孵育，加入二抗（1:2 000 稀释），常温摇床孵育1 h，PBST 振荡冲洗3 次，每次5 min，加入ECL 显色液，放入化学发光成像仪中曝光，将TGF-β1、p38MAPK、p-p38MAPK、α-SMA、MMP-9 与β-actin 灰度值相比得出目的蛋白相对表达量。

1.3 统计学分析 采用SPSS 20.0 统计学软件分析数据，符合正态分布的计量资料均以均数±标准差（）描述，多样本计量资料比较采用单因素方差分析，两两样本比较采用SNK-q 检验。

2 结果

2.1 各组血清ALT、AST 水平比较 与对照组比较，模型组血清ALT、AST 水平均升高（P＜0.05）；与模型组比较，藤茶总黄酮低剂量组、藤茶总黄酮高剂量组及激动剂组血清ALT、AST 水平均降低，其中藤茶总黄酮高剂量组低于藤茶总黄酮低剂量组和激动剂组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组血清ALT、AST 水平比较（，n =13）

表2 各组血清ALT、AST 水平比较（，n =13）

注：与对照组比较，#P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05；与低剂量组比较，▲P ＜0.05；与高剂量组比较，□P ＜0.05

2.2 各组肝组织病理学染色观察 对照组大鼠肝细胞排列紧密饱满，肝细胞大小正常，结构清晰，未见异常。模型组肝细胞排列紊乱，细胞间隙有明显脂肪变性，肝组织纤维化严重，肝小叶有结缔组织异常增生形成假小叶。藤茶总黄酮低剂量组肝细胞排列杂乱，肝小叶间有少量变性脂肪填充，汇管区少量增生组织。藤茶总黄酮高剂量组肝细胞排列稍乱，肝小叶间未见脂肪填充，肝小叶结构未见浸润性坏死，肝结构完整，汇管区未出现纤维化。激动剂组肝小叶间胶原纤维增生，肝细胞间有散在的脂肪细胞浸润，有胶原沉淀。见图1。

图1 肝组织病理学改变（HE×400）

2.3 各组肝组织中ColIColⅢ水平比较 与对照组比较，模型组Col Ⅰ、Col Ⅲ水平均升高（P＜0.05）；与模型组比较，藤茶总黄酮低剂量组、藤茶总黄酮高剂量组、激动剂组Col Ⅰ、Col Ⅲ水平均降低，其中藤茶总黄酮高剂量组Col Ⅰ水平低于藤茶总黄酮低剂量组及激动剂组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 各组肝组织中Col Ⅰ、Col Ⅲ水平比较（，n =13）

表3 各组肝组织中Col Ⅰ、Col Ⅲ水平比较（，n =13）

注：与对照组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05；与低剂量组比较，▲P ＜0.05；与高剂量组比较，□P ＜0.05

2.4 各组肝组织中TGF-β1、p38MAPK、α-SMA、MMP-9 mRNA 表达比较 p38MAPK mRNA 相对表达量组间比较，差异无统计学意义（P＜0.05）。与对照组比较，模型组TGF-β1、α-SMA、MMP-9 mRNA相对表达量上升（P＜0.05）；与模型组比较，藤茶总黄酮低剂量组、藤茶总黄酮高剂量组及激动剂组TGF-β1、α-SMA mRNA 相对表达量降低（P＜0.05），MMP-9 mRNA 相对表达量升高（P＜0.05），其中藤茶总黄酮高剂量组TGF-β1、α-SMA 低于藤茶总黄酮低剂量组及激动剂组，MMP-9 高于TF 低剂量组及激动剂组，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 TGF-β1、p38MAPK、α-SMA、MMP-9 mRNA 相对表达量比较（，n =13）

表4 TGF-β1、p38MAPK、α-SMA、MMP-9 mRNA 相对表达量比较（，n =13）

注：与对照组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05；与低剂量组比较，▲P ＜0.05；与高剂量组比较，□P ＜0.05

2.5 各组肝组织中TGF-β1、p38MAPK、p-p38MAPK、α-SMA、MMP-9 蛋白表达比较 p38MAPK 蛋白相对表达量组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与对照组比较，模型组TGF-β1、p-p38MAPK、α-SMA、MMP-9 蛋白相对表达量升高（P＜0.05）；与模型组比较，藤茶总黄酮低剂量组、藤茶总黄酮高剂量组及激动机组TGF-β1、α-SMA、p-p38MAPK 蛋白相对表达量降低（P＜0.05），MMP-9 蛋白相对表达量升高（P＜ 0.05），其中藤茶总黄酮高剂量组TGF-β1、α-SMA、p-p38MAPK 比藤茶总黄酮低剂量组及激动机组低，MMP-9 比藤茶总黄酮低剂量组及激动机组高，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；激动剂组与藤茶总黄酮低剂量组比较，TGF-β1、p-p38MAPK、α-SMA、MMP-9 蛋白相对表达量均无明显变化（P＞0.05），见图2 和表5。

表5 TGF-β1、p38MAPK、p-p38MAPK、α-SMA、MMP-9 蛋白相对表达量比较（n =13）

图2 各组Western blot 蛋白条带图

3 讨论

肝纤维化是肝星状细胞被反复破坏后持续修复的病理过程，是肝硬化形成的关键步骤[6]。TGF-β1/p38MAPK 作为影响肝纤维化的重要通路，与细胞因子形成、炎性因子调节、应激反应激活等过程紧密相关[7]。藤茶总黄酮作为中华民族的传统中草药，已有数百年历史，具有抗氧化、调节血糖、血压和体外抗肿瘤活性等作用，中医认为，肝气瘀滞是肝纤维化的发病机理，益气养阴，活血化瘀是中药的基本治法[8-9]。已有药效研究[10-11]表明藤茶总黄酮可以梳理肝气，改善肝脏受损组织，抵抗肝脏纤维化，但具体作用机制目前仍不明确。本研究通过探讨TGF-β1/p38MAPK 通路阐述藤茶总黄酮修复肝纤维化的作用机制，为进一步阐明藤茶总黄酮修复肝损伤机制奠定基础。

本研究发现模型组细胞外基质异常沉积，肝组织结缔严重，肝脏明显纤维化，提示大鼠肝纤维化模型构建成功。有研究报道[12-13]，CCl4经肝脏代谢后生成三氯甲基攻击细胞膜，从而破坏细胞膜完整性，损坏肝脏结构，形成肝纤维化，因此CCl4是构建大鼠肝纤维化模型的最佳选择。病理学结果显示，藤茶总黄酮低剂量组、高剂量组、激动剂组肝纤维化程度明显改善，其中高剂量组肝脏结构较好，提示藤茶总黄酮可改善肝组织病理损伤程度。与对照组比较，模型组血清ALT、AST、ColI、ColⅢ水平均升高，与模型组比较，藤茶总黄酮低剂量组、高剂量组及激动剂组血清ALT、AST、ColI、ColⅢ水平均降低，其中藤茶总黄酮高剂量组ALT、AST、ColI 水平低于低剂量组和激动剂组，提示藤茶总黄酮可以降低血清ALT、AST、ColI、ColⅢ水平，改善肝脏功能。ALT、AST 主要分布于肝脏细胞质及线粒体中，两者血清中含量变化可以反映肝脏细胞结构的完整性[14]。ColI、ColⅢ主要分布于肝细胞外基质，ColI、ColⅢ水平的变化反映肝纤维化严重程度。

研究[15]显示TGF-β1 是一种强促胶原蛋白生成因子，可以激活p38MAPK 磷酸化，一方面促进肝星状细胞的激活与增殖，抑制MMP-9 合成，减少细胞基质降低；另一方面促进α-SMA 高表达，导致肌成纤维细胞分化，促进胶原蛋白合成，进一步加重肝纤维化形成。抑制MMP 细胞外基质降解，加速肝纤维化病程发展，TGF-β1 在肝组织中的表达与肝纤维化病理程度息息相关[16-17]。本研究发现，与对照组比较，模型组TGF-β1、α-SMA、MMP-9 mRNA、蛋白相对表达量上升，p-p38MAPK 蛋白相对表达量上升；与模型组比较，藤茶总黄酮低剂量组、高剂量组及激动机组TGF-β1、α-SMA mRNA、蛋白相对表达量降低，p-p38MAPK 蛋白相对表达量降低，MMP-9mRNA 和蛋白相对表达量均升高，其中藤茶总黄酮高剂量组TGF-β1、α-SMA mRNA、蛋白相对表达量及p-p38MAPK 蛋白相对表达量均低于藤茶总黄酮低剂量组及激动剂组，MMP-9mRNA 和蛋白相对表达量均高于藤茶总黄酮低剂量组及激动剂组，提示藤茶总黄酮可以抑制TGF-β1/p38MAPK 通路表达，激活MMP-9 活性，促进细胞基质降解，降低α-SMA 表达，抑制p38MAPK 磷酸化，降低胶原蛋白形成，并且随着剂量增加，进一步下调TGF-β1/p38MAPK 通路表达，改善疾病进程。

综上所述，藤茶总黄酮可能通过调控TGF-β1/p38MAPK 通路，逆转肝纤维化损伤，改善受损肝脏，为肝纤维化的预防和治疗提供理论依据，并为藤茶总黄酮在抗肝纤维化的综合利用及全面开发提供科学依据。