“人参-黄连”药对成分分析及对α-葡萄糖苷酶的影响

李春楠，张凯月，杜延佳，吕金鹏，杨小倩，张 辉*

（1.长春中医药大学，长春 130117；2.吉林省东北亚生物科技有限公司，长春 130117）

人参黄连药对出自《万病回春》中“参连饮”，具有益气生津，清热燥湿的功效，是中医治疗“消渴症”古方中清热益气药的代表。人参具有补气固脱，健脾益肺，宁心益智，养血生津的作用，在张仲景的《伤寒杂病论》中对人参已有记载“白虎加人参治疗消渴”；而《本草纲目》对黄连有记载“治消渴”用“酒蒸黄连”，证明黄连可治疗消渴症。现代药理研究证实，人参黄连配伍能够调节空腹血糖、血胰岛素，改善胰岛素抵抗，被广泛地应用于糖尿病的临床治疗[1]。另外，人参-黄连药对配伍，其降糖作用要高于单味中药的降血糖活性作用[2]。中药具有多成分、多活性作用的多样性特点，其多个配伍在疾病治疗上具有其独特的优势。

中医学范畴的“消渴病”即是现代所指的糖尿病，是由胰岛素抵抗、胰岛素相对或绝对不足引起的内分泌代谢紊乱，并最终导致血糖升高和并发症的发生[3]。人参、黄连及其药对是治疗糖尿病的代表性中药，运用广泛且效果显著，毒副作用少，不过其活性成分并不十分清楚，本研究应用HPLC-MS 技术及α-葡萄糖苷酶对人参、黄连进行成分活性研究，为人参黄连药对的临床应用及相关药品研发提供参考依据。

1 仪器与试药

安捷伦1100 液相色谱仪；美国Agilent 6320 离子阱LC/MS，该系统配有G1315B 二极管阵列检测器；KH-250DB 型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；全自动酶标记仪(BIO-RAD-680)；MS204S 型分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rf、人参皂苷Re、小檗碱的标准品购自上海源叶生物有限公司；100U α-葡萄糖苷酶（Sigma 公司）；人参、黄连分别采自吉林和内蒙古，经长春中医药大学张辉教授鉴定分别为五加科植物人参Panax ginseng C.A.Meyer 的干燥根，毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch.根茎；乙腈（Fisher）、甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水是娃哈哈纯净水。

2 方法

2.1 供试品制备 取人参粉末，甲醇30 mL 超声30 min，过滤，取续滤液，水浴蒸干，加水使溶解，水饱和正丁醇萃取3 次，合并正丁醇液，蒸干，加甲醇10 mL 使溶解，大孔吸附树脂上样，待样品液面与大孔树脂相水平后，100 mL 70%乙醇洗脱，续滤液蒸干，30 mL 甲醇溶解，即得；黄连药材粉末，加50%乙腈-盐酸（100:1）50 mL，超声处理30 min，用50%乙腈-盐酸（100:1）补足失去的重量，精密称取2 mL 溶液，置10 mL 的容量瓶中，定容，摇匀，即得。

2.2 HPLC-MS 检测条件 质谱条件：电喷雾源参数设置气体温度为350℃；毛细管电压为4000 伏；喷雾器压力为35 psi；干燥气体为9.0 L/min；撇油器电压为60 V；鞘气和辅助气体为氮气；扫描范围为50～1 200 m/z。

人参皂苷的色谱条件：Agilent EC-C18 色谱柱（150 mm×4.6 mm，2.7 μm）；流动相由乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）梯度洗脱：0～5 min，19%→30% A；5～25 min，30%→40% A；25～40 min，40%→90% A；40～46 min，90%→95% A；流速为0.8 mL/min；柱温25 ℃；检测波长为203 nm；进样量为10 μL。黄连生物碱色谱条件：Agilent Xcharge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.25 mol/L 乙酸铵和8 mmol/L 十二烷基硫酸钠（SDS）水溶液（氨水调节pH 为9.3）（B），洗脱40 min，40% A；柱温30 ℃；流速为1 mL/min；检测波长为270 nm；进样量为8 μL。

2.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性测定 根据参考文献[4-5]，方法略作变动，实验分为空白组、样品组和阳性对照组，一次加入PBS 缓冲液、样品和0.5 U/mL α-葡萄糖苷酶，在37 ℃摇床中孵育15 min 后，加入PNPG（5 mmol/L）底物溶液，孵育20 min，加入0.2 mol/L Na2CO3终止反应，405 nm 处测定吸光度，抑制率计算公式为Inhibitory rate=（A0-A1）/（A0-AB）A0、A1 和AB 分别是对照、样品和空白的吸光度。

3 结果

3.1 HPLC-MS 分析结果 用高效液相色谱-电喷雾质谱联用仪对人参、黄连提取物进行分析，并与标准化合物的峰进行了比较，通过比较保留时间、质谱数据、MS2 数据，鉴定出11 种化合物，HPLC 图谱见图1，高效液相色谱—电喷雾质谱数据如表1 所示。

表1 HPLC-ESI-MS 数据结果

图1 人参（A）、黄连（B）的液相色谱图

3.2 方法学考察结果 取标准品溶液，连续 6 次进样，结果人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、盐酸小檗碱的RSD为 1.2%、0.9%、1.3%和 1.6%（n=6），说明该仪器的精密度较好；分别取等量供试品5 份，分别进样4 化学成分的 RSD 在 1.5%～2.1%，说明方法重现性良好；取人参、黄连供试品溶液1 份，分别在0、2、4、8、16、24 h 后进样，结果化合物RSD 在0.8%～2.4%，说明样品在制备24 h 内稳定性良好；分别称取供试品配制成最终浓度1 mg/mL，分别精密加入一定量对照品，进样测定，计算加样回收率，结果加样回收率（n=6）在97.15%-107.31%，RSD 在0.8%～2.8%之间，表明本方法回收率良好，具体线性关系结果见表2。

表2 主要化学成分线性关系

3.3 体外α-葡萄糖苷酶抑制活性检测 人参皂苷和生物碱对α-葡萄糖苷酶的抑制活性 我们进一步研究了3 种人参皂甙和2 种生物碱在体外对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。阿卡波糖作为阳性对照药物，其IC50=0.65 mg/mL，结果如表3 所示。

由表3 可知，盐酸药根碱和盐酸小檗碱具有明显的抑制作用，人参皂苷Rb1、人参皂苷Re 对α-葡萄糖苷酶的抑制作用较差。通过以上研究，我们可以得出结论，人参皂苷和生物碱都是具有降糖作用的，但体外试验表明生物碱是参连饮中对α-葡萄糖苷酶抑制作用较强的成分，可能人参皂苷通过增加胰岛素分泌或体内其他机制具有更好的抗高血糖作用。

表3 人参皂苷和生物碱对α-葡萄糖苷酶抑制作用

4 讨论

本研究采用高效液相色谱—质谱联用技术鉴定了参连饮中人参、黄连当中主要成分人参皂苷和生物碱，结果证明一些人参皂苷成分、生物碱在体外α-葡萄糖苷酶有显著的抑制作用，通过HPLC-MS 对中药活性成分的鉴定和检测为该药对在临床应用提供了一些实验参考数据，本研究采用高效液相色谱—二极管阵列检测器方法，建立了检测人参皂苷和生物碱的分析方法。实验结果表明，该方法能够全面检测出人参、黄连主要成分，体外α-葡萄糖苷酶抑制试验可能无法通过其抗高血糖特性充分反映体内成分的作用及其对人体的健康促进特性，因此需要对其生物活性进行进一步的细胞和体内研究。这些结果表明，综合分析该方剂的化学成分和药理活性，有助于揭示其在临床应用中的可行性和可靠性。