小分子探针2-叠氮乙酰氨基-1,3,4,6-四乙酰基葡萄糖的合成

王淳滨，楚 俏，刘 康，郝梦林，张茹梦，马 静，王佳佳

(1.河南大学 第一附属医院，抗体药物开发技术国家与地方联合工程实验室 河南，开封，475001；2.河南大学 临床学院 河南，开封，475001；3.河南大学 药学院，河南，开封，475001)

0 引言

在真核生物中，翻译产生的蛋白质通常需要被进一步加工修饰，以满足其结构、活性、功能的需求。据报道，蛋白质翻译后修饰包括糖基化、乙酰化、磷酸化、甲基化等[1-5]。其中蛋白质的糖基化修饰在维持细胞正常生理功能以及参与病理变化过程中起着至关重要的作用[6]。蛋白质的糖基化修饰是将低聚糖与蛋白质上特殊的氨基酸以共价结合的方式组合到一起，包括N-连接的糖蛋白，O-连接的糖蛋白等。其中O连接的N-乙酰葡糖胺(O -linked β-N-acetyl glucosamine,O-GlcNAc)糖基化是一类特殊的O-糖基化修饰[7-10]，主要发生在苏氨酸和丝氨酸残基。O-GlcNAc糖基化在肿瘤[11,12]、糖尿病[13,14]等慢性疾病发生时，常常伴随着O-GlcNAc糖基化异常激活或沉默，故探究不同疾病中O-GlcNAc糖基化水平的变化对进一步明确发病机制具有重要意义。此外，O-GlcNAc糖基化与磷酸化修饰相似，可在环境因素的刺激下通过酶的调节作用进行糖基化与去糖基化，从而调控复杂的生命活动[15-17]，但与磷酸化修饰不同的是，参与调节糖基化与去糖基化的酶只有O-GlcNAc 转移酶(O-GlcNAc transferase,OGT)和O-GlcNAc 水解酶(O-GlcNAcase,OGA)[18]。氨基己糖生物合成途径可以将葡萄糖转化为UDP-N-乙酰葡萄胺(UDP-N -acetylglucosamine,UDP-GlcNAc)，从而被OGT识别并与目的蛋白连接，研究发现经叠氮或者炔基官能团修饰的非天然糖可以经由相应的补救途径转变为UDP形式的糖，进而被OGT识别并利用[19-24]，随后利用叠氮-炔基环加成反应可以对O-GlcNAc糖基化的蛋白定位或者对靶蛋白富集，为O-GlcNAc糖基化异常相关疾病的研究提供新的途径。目前已报道多种叠氮或者炔基修饰的非天然小分子探针用于研究O-GlcNAc糖基化蛋白种类和位点鉴定(图1)[19,21,24]。其中2-脱氧-N-叠氮乙酰氨基全乙酰化葡萄糖Ac4GlcNAz和相应的半乳糖构型Ac4GalNAz是两种经典探针，其合成方法一般是以氨基葡萄糖或者氨基半乳糖为起始原料，在甲醇、金属钠条件下与氯乙酸酐反应生成2-脱氧-N-氯乙酰基取代的裸糖中间体，通过叠氮化和全乙酰化得到目标产物。虽然该方法步骤简短，但是反应中所需的金属钠存在一定的安全隐患[19]。此外，某些课题组将葡萄糖氨基盐酸盐与叠氮乙酸直接耦连，再进行全乙酰化，该方法中所需的叠氮乙酸价格较高[25]。因此，开发安全、高效、经济的方法用于合成该类探针，对推动O-GlcNAc相关领域的科学研究具有重要的意义。

图1 已报道的O-GlcNAc糖基化小分子探针

本文以氨基葡萄糖盐酸盐为起始原料，经过一系列反应得到小分子探针6，总收率44%，经Western blot 检测发现6具有高效的糖基化标记效率，为后续O-GlcNAc糖基化等相关研究提供基础。此外，在步骤3中化合物4在丙酮、浓盐酸、50 ℃的条件下得到中间体7，该中间体在365 nm下具有很强的吸收，本文通过核磁质谱等方法进一步确定其结构，结果表明中间体7是一种与查耳酮以及姜黄素结构类似的化合物，在抗癌和抗氧化活性方面具有重要的生物学意义[26-28]。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

葡萄糖氨基盐酸盐购买自北京凯森莱科技有限公司；茴香醛，氯乙酰氯购买于百灵威试剂有限公司；核磁检测采用Bruker 300 M和400 M核磁共振，LC-MS分析仪器采用Waters 3100。

1.2 实验方法

1.2.1 化合物3的合成。将化合物1(10 g，46 mmol)溶解在10.2 mL的5 mol/L 氢氧化钠溶液中，在冰浴条件下搅拌，随后加入茴香醛(5.64 mL，46 mmol，1 eq)，待反应凝成固体在4 ℃保存过夜。次日将混合物用水，乙醇，石油醚：乙酸乙酯10：1冲洗抽滤，干燥，得到化合物12.6 g2，产率88%，不需纯化，直接用于下一步合成；取部分化合物2(3.97 g，13.8 mmol)溶解在20 mL 的吡啶溶液中，在冰浴条件下搅拌，随后逐滴加入乙酸酐(7.84 mL，83 mmol，6 eq)，在冰浴条件下逐渐恢复室温，搅拌过夜。次日用二氯甲烷与稀盐酸萃取，干燥，得到化合物3(5.8 g)，产率91%。1H NMR (400 MHz,CDCl3) δ 8.21 (s，1H),7.67 (d,J=8.4 Hz,1H),6.92 (d,J=8.4 Hz,1H),5.94 (d,J=8.0 Hz,1H),5.46 (d,J=3.2 Hz,1H),5.26 (dd,J=10.4,3.0 Hz,1H),4.27-4.07 (m,3H),3.84 (s,3H),3.68-3.53 (m,1H),2.17 (s,3H),2.06 (s,3H),2.03 (s,3H),1.89 (s,3H);13C NMR (100 MHz,CDCl3) δ 170.40,170.09,169.63,168.69,164.47,162.32,130.27,114.07,93.52,71.78,71.56,68.76,65.98,61.33,55.42,20.77,20.68,20.51.HRMS (ESI):m/z [M+NH4]+calculated for C22H27NO10:465.1635,found:465.1637.

1.2.2 化合物4和7的合成。将化合物3(5 g，10.7 mmol)溶解在适量的丙酮中，放上冷凝管，升高温度至50 ℃，搅拌10 min，迅速加入2.5 mL浓盐酸，立即生成大量固体，待其冷却至室温，加入适量的乙醚，出现颗粒状悬浮，用纸盖住烧杯口，放入冰水等待2-3 h。加入石油醚：乙酸乙酯10：1冲洗抽滤，干燥，得到化合物4(3.5 g)，产率85%，直接用于下一步的合成；中间体7的核磁数据：1H NMR (300 MHz,CDCl3) δ 7.72 (d,J=15.6 Hz,2H),7.62 (d,J=8.7 Hz,4H),7.03-6.96 (m,6H),3.89 (s,6H)；13C NMR (75 MHz,CDCl3) δ 188.90,161.59,142.71,130.11,127.68,123.54,114.45,55.44.

1.2.3 化合物5的合成。将化合物4(3 g，7.8 mmol)在真空条件下溶解在20 mL二氯甲烷中，插上气球，随后加入5 mL吡啶，将反应处于冰浴条件下，持续搅拌，随后逐滴加入氯乙酰氯(1.22 mL，15 mmol，2 eq)，过夜，加入适量的甲醇淬灭反应，搅拌10 min，浓缩后用稀盐酸与二氯甲烷萃取，干燥，得到化合物5(3.3 g)，产率89%。1H NMR (400 MHz,CDCl3) δ 6.42 (d,J=8.8 Hz,1H),6.19 (d,J=3.6 Hz,1H),5.31-5.17 (m,2H),4.46-4.40 (m,1H),4.25 (dd,J=12.4,4.0 Hz,1H),4.07-3.90 (m,2H),3.92 (s,2H),2.19 (s,3H),2.07 (s,3H),2.04 (s,3H),2.03 (s,3H);13C NMR (100 MHz,CDCl3) δ 170.47,170.16,169.37,166.73,92.46,71.85,69.85,66.37,61.28,50.36,42.44,20.89,20.69,20.62.HRMS (ESI):m/z [M+NH4]+calculated for C16H22ClNO10:423.0932,found:423.0935.

1.2.4 化合物6的合成。将化合物5(1.8 g，4.2 mmol)与NaN3(0.54 g，8 mmol，2 eq)混合，加入10 mL DMF溶解，搅拌，升温至70 ℃，反应过夜。次日，旋蒸将DMF旋出，经硅胶层析柱分离纯化(石油醚：乙酸乙酯=3：1)，得到1.3 g目标化合物6，产率72%。1H NMR (400 MHz,CDCl3) δ 6.42 (d,J=8.8 Hz),6.19 (d,J=3.6 Hz),5.31-5.17 (m,2H),4.46-4.40 (m,1H),4.25 (dd,J=12.4,4.0 Hz,1H),4.07-3.90 (m,2H),3.92 (s,2H),2.19 (s,3H),2.07 (s,3H),2.04 (s,3H),2.03 (s,3H).13C NMR (100 MHz,CDCl3) δ 171.51,170.64,169.13,168.65,166.87,90.26,70.34,69.81,67.43,61.49,52.43,51.24,20.66.HRMS (ESI):m/z [M+NH4]+calculated for C16H22N4O10:448.1680,found:448.1677.

1.2.5 细胞的培养和代谢标记。将HEK293T细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，在温度为37 ℃和5.0%二氧化碳的培养箱中。待细胞长至80%-85%密度，向细胞中加入终体积为200 μmol/L Ac4GlcNAz或相应体积的DMSO作为对照，于培养箱中继续培养24 h。

1.2.6 Western blot检测探针6标记效率。将细胞转移至1.5 mL离心管，500 r/min离心5 min，去除培养基后，用无菌PBS清洗两遍；在每个小皿中加入200 μL细胞裂解液(1×lysis buffer、PMSF、25倍蛋白酶抑制剂、10倍磷酸酶抑制剂)，于4 ℃层析柜中，裂解30 min；裂解结束后，12000 r/min、4 ℃离心10 min；离心结束后，将含有蛋白的上清液取出到新的EP管中并进行BCA蛋白定量；取200 μg体积蛋白，另取一支1.5 mL离心管依次加入170 μL裂解液，0.2 μL 100 mmol/L CuSO4(终浓度100 μmol/L),0.4 μL 100 mmol/L THPTA (CuSO4:THPTA=1:2,摩尔数比)，0.2 μL 100 mmol/L Biotin-PEG-Alkyne(终浓度100 μmol/L)，室温反应2 h，在蛋白样品中加入1 mL冰甲醇，于-80 ℃静止2 h，取出后于10000 g，4 ℃离心10 min；加入500 μL冰甲醇，吹洗蛋白，再次离心，弃掉上清液，蛋白于室温晾干15 min；每管加入80 μL 4% SDS buffer(4% SDS,150 mmol/L，50 mmol/L TEA pH7.4)，另加20 μL 5×loading buffer，煮沸10 min；配胶，每孔上样30 μL蛋白，进行电泳分析；电泳结束后，以280 mA、180 min进行转膜(NC膜，GE公司)；将转好的膜在TBST配置的5%脱脂牛奶中在室温下进行封闭；孵育HRP-Streptavidin(1:10000稀释)，1 h后，PBST清洗3×10 min；)对清洗过后的膜加入化学发光液爆片分析。

2 结果与讨论

本课题以商品化的葡糖糖氨基盐酸盐为起始原料，在5 M氢氧化钠作用下与对甲氧基苯甲醛作用生成亚胺结构，对葡萄糖的二位氨基进行临时保护；随后在吡啶和醋酸酐的作用下进行全乙酰化保护得到中间体3；接着在滴加少量浓盐酸的热丙酮溶液中脱除二位保护基，静置冷却至室温，加入乙醚混匀并抽滤，得到关键中间体4；最后在吡啶溶液中与氯乙酰氯反应在二位引入氯乙酰基，并发生叠氮化，最终顺利得到目标产物2-叠氮乙酰氨基-1,3,4,6-四乙酰基葡萄糖6(图2)，并通过核磁、验证其结构确实为理想产物。我们将200 μmol/L探针6与Hek293T细胞孵育24 h，设置空白对照组，收集细胞并裂解提取蛋白，通过与Biotin-PEG4-Alkyne发生click反应，最终经由western blot检测发现我们合成的探针6与对照组相比具有很高的标记效率(图3)，与之前报道的文献一致[19]。

图2 糖代谢分子探针6的合成路线

图3 化合物6在293T细胞进行糖基化标记的机制和结果

此外，在合成目标化合物6的过程中，我们发现步骤3即浓盐酸和50 ℃丙酮的条件下，生成了一种在365 nm紫外灯照射下具有强烈吸收，且极性偏小的副产物，具备一般荧光探针的特性。为探究其具体结构，首先我们将反应液混合物进行液质联用分析，结果如图4所示，液相中保留时间为2.64与9.42 min位置呈现两组峰(图4(a))，根据化合物的极性分析，保留时间9.42 min为我们重点研究的荧光化合物，其对应的质谱图发现对应的分子离子峰的分子量为295.5 m/z(图4(b)),与理论计算值295.3相符；为进一步确定中间产物7的结构，我们将其经柱层析纯化，通过核磁氢谱和质谱确定其结构如图2所示，为一种具有对称结构的α，β不饱和酮，是一种与查耳酮以及姜黄素结构类似的化合物。

图4 通过LC-MS分析化合物7的结构

根据中间体7的结构，本文推测了其生成的可能机理(图5)。首先，在酸性条件下丙酮的羰基氧被质子化，通过异构共振形成具有亲核性能的碳负离子中间体d；其次，从糖环上脱下来的保护基对甲氧基苯甲醛在酸性条件下被质子化，与d发生亲核加成生成β-羟基酮f，中间体f在加热条件下失去一分子水，生成α，β-不饱和醛h；随后，h再次或者同时发生类似的过程即可得到中间体7。

图5 中间体7生成的可能机理

为进一步分析中间体7的荧光性能，我们首先对中间体7进行了全波长扫描，结果发现其最大吸收波长为362 nm(图6(a))，与姜黄素的吸收波长为425 nm相比较短，其原因是7结构中苯环上的甲氧基的供电效应不如羟基高，致使吸收波长的差异。随后，我们配制了化合物7的系列浓度梯度，并在362 nm下检测吸收与浓度的依赖性(图6(b))，结果表明，在固定波长下，中间体7展现了良好的浓度依赖性。

图6 中间体7的全波长扫描及浓度与波长的关系

3 结论

本文以氨基葡萄糖盐酸盐为原料，通过5步反应得到目标产物6，通过western blot实验表明化合物6可以高效标记O-GlcNAc糖基化蛋白。因化合物6结构中含有叠氮官能团，可利用叠氮-炔基环加成反应进行荧光标记和目标蛋白富集，对O-GlcNAc糖基化蛋白质的标记及其相关研究有重要的细胞生物学意义。此外，实验中还发现了一种有趣的中间体7，并通过NMR和HRMS等确定其结构，结果表明中间体7是一种与姜黄素结构类似的化合物，具有较强的荧光性能。因此，我们推测中间体7将来可用于开发一种高效、低毒的新型光敏剂，其次可能在诱导细胞凋亡、活血止痛具有重要的生物学意义[25-27]。