烟叶稳定碳同位素组成受控因素分析

毛佳琦，郑允允，张二强，王 培，付玉洁，王 瑶

（1.浙江大学中原研究院，河南 郑州 450001；2.陕西中烟工业有限责任公司技术中心，陕西 宝鸡 721013）

【研究意义】碳的两种稳定性同位素12C 和13C 因原子质量不同而使其在分解速率、化学键能强度、气相中传导速率等物理化学性质上具有差异性，从而导致植物体生物化学反应前后碳同位素组成（δ13C）的改变，即同位素分馏［1］。C3 植物的δ13C 值分布在-22‰～-35‰，该值与植物生理特征、遗传特性、生长环境、光合作用类型等多种因素密切相关［2］。烟叶属C3 植物，是一种对生态环境较为敏感的经济作物，在烤烟种植过程中生态环境的差异会对叶片的光合速率、水分利用效率和气孔开闭等各种生理状态产生影响，导致不同生态种植区烟叶δ13C 值存在差异。【前人研究进展】烟叶13C 值受非生物因素如水分、温度、光强和光质、土壤盐分、CO2浓度、海拔高度、经度、纬度等和生物因素如烟叶部位、叶片成熟期、叶片结构等多种因素影响，因此，烟叶δ13C 值是烟叶种植产地气候环境信息和其内部复杂生理生态过程的综合表征［2-4］。不同生态种植区的烟叶由于气候环境条件影响，导致不同种植区烟叶δ13C 值存在差异。自20 世纪50 年代发现不同植物间稳定碳同位素组成存在差异以来［5-6］，随着质谱测定技术发展，稳定碳同位素技术在植物水分利用效率、光合作用途径、植物群落水平、树木年轮、土壤-植物碳循环、植物对气候变化响应和适应、农产品产地溯源等方面得到广泛应用［7-12］，在生理生态学领域主要用于研究稳定碳同位素组成的小范围变化与作物品种差异的关系及环境因子对植物稳定碳同位素组成的影响［13-14］。而烟叶稳定碳同位素的研究起步相对较晚且相关报道较少，主要集中在烟叶δ13C 值与其生理品质特征、化学成分的关系等方面［3,15-16］。【本研究切入点】目前关于烟叶稳定碳同位素组成与叶位和经纬度的关系及不同香型的烤烟碳同位素组成的差异等方面鲜有报道。【拟解决的关键问题】本研究通过探索烟叶稳定碳同位素组成与叶位关系并进行横向、纵向（纬度、经度）对比，探讨分析烟叶稳定碳同位素组成的受控因素，以及碳同位素组成对不同香型烟叶的聚类差异，以期为烟草种植评价指标体系的完善及生态适应性机理研究提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

按《中国烟草种植区划》［17］中划分的一级烟草种植区选取其中4 个种植区为研究区域，分别为西南烟草种植区（云南、贵州等地）、东南烟草种植区（江西、福建等地）、长江中上游烟草种植区（重庆、湖北、湖南等地）和黄淮烟草种植区（陕西、河南等地）。按照烟叶着生部位不同分别随机选取384 株不同产地的烟田中达到生理成熟期的烟草植株的上部烟叶（自下而上第3～5 叶位叶片）、中部烟叶（自下而上第9～11 叶位叶片）和下部烟叶（自下而上第15～17 叶位叶片）为试验材料，样品涉及14 个二级划分区9 个省24 个地市，具有分布范围广、类型全、数量多等特点，具有一定的代表性。采集后的样品用蒸馏水洗净后截取每片叶片的中心部位（同一片叶子的中间部位是气孔密度和气孔指数最稳定的区域［18］）于70℃烘干，粉碎后过178 μm 筛备检。

1.2 试验方法

稳定碳同位素组成测定：处理后的样品在高纯氧气条件下经高温充分燃烧后生成CO2，提取燃烧产物CO2，采用Flash2000-MAT253 同位素分析仪（美国ThermoFisher 公司）测定稳定碳同位素比率，分析结果参照国际标准（Pee Dee Belnite或PDB），根据如下公式计算：

式中，δ13C 表示烟叶稳定碳同位素组成；(13C/12C)PDB表示南卡罗来纳州白碚石中的13C/12C。

检测条件：标准样品IAEA-600（caffeine，δ13CV-PDB=-27.771‰±0.043‰，δ15Nair=-1.0‰±0.2‰），氧化温度960 ℃，载气流速100 mL/min，氧气流速280 mL/min。

试验数据采用IBM SPSS 20.0 进行统计分析，图表采用OriginPro8.5 绘制。

2 结果与分析

2.1 烟叶稳定碳同位素组成随经纬度分布情况

基于全球尺度对植物的生长研究发现，随着经纬度变化，在各种环境因子如温度、降水的影响下，植物形成了对环境变化的不同响应，δ13C 值与经纬度具有一定相关性［19-20］。本研究所选取的样本种植区覆盖99°17′E～118°26′E、23°88′N～35°53′N，东西跨越19 个经度，南北跨越12 个纬度，样本δ13C 值分布范围为-27.76‰～-25.39‰，平均值为-26.46‰。

2.1.1 烟叶δ13C 值随经度的变化 如图1 所示，在99°17′E～118°26′E 范围内，烟叶δ13C 值呈现随经度增加而逐渐减小的趋势，δ13C 值与经度之间呈极显著负相关性，从地理位置上自西向东，经度每增加1°，烟叶δ13C 值减小0.09‰。经度变化本身并不会对植物δ13C 值产生影响，而是由于随着地理位置变化而改变的环境因子（如温度、降水等）造成植物δ13C 值空间分布的差异性［20-21］。

图1 烟叶δ13C 值随经度的分布Fig.1 Distribution of δ13C values of tobacco leaves with longitude

我国气温和降水量分别呈现自西向东逐渐降低和梯度增加的特点，在99°17′E～118°26′E范围内，气候呈现东面湿润、西面较干燥的特点，东部地区阴雨天时间较多，而西部地区天晴少雨的时间更长。当降水量减少时，水分胁迫加剧，土壤及空气含水量降低，植物往往通过关闭部分气孔来降低气孔传导速率，叶内CO2浓度降低，对13C 的辨别力降低，叶片光合作用所固定的δ13C值增加［1］。而温度升高同样也会导致土壤水分蒸发加快从而降低土壤水分可利用量，使δ13C 值偏正。而个别经度范围如109°41′E～109°76′E，烟叶δ13C 值呈现略增大趋势，这可能是该地域范围内其他环境因素协同作用的结果。

2.1.2 烟叶δ13C 值随纬度的变化 试验结果显示，在23°88′N～35°53′N 地区范围之内，烟叶δ13C 值与纬度之间无显著线性相关性（图2A），与一些C3 植物如艾蒿、藜、平车前等的δ13C 值与纬度呈显著负相关性的研究结果有所不同［14］。进一步分析发现，在23°88′N～27°50′N 范围内，由南向北，烟叶δ13C 值由重逐渐变轻；在27°50′N～35°53′N 范围内，烟叶δ13C 值由南向北则呈现由轻逐渐变重的特征，整体呈现以N27°50′为谷底的“V”字型变化特征，采用二次曲线对结果进行拟合（图2B）后发现δ13C 值与纬度平方的回归方程达到显著水平，总体而言，烟叶δ13C 值表现出随纬度增加先降后升的趋势。

图2 烟叶δ13C 值随纬度的分布Fig.2 Distribution of δ13C values of tobacco leaves with latitude

2.2 不同叶位稳定碳同位素组成差异

图3 为4 个一级种植区不同叶位烟叶稳定碳同位素组成分布。长江中上游种植区烟叶δ13C 值在-28.05‰～-25.28‰之间，均值为-26.74‰；黄淮种植区烟叶δ13C 值在-27.95‰～-24.70‰之间，均值为-25.94‰；东南种植区烟叶δ13C 值在-28.79‰～-25.65‰，均值为-27.19‰；西南种植区烟叶δ13C 值在-27.50‰～24.90‰之间，均值为-25.93‰；西南种植区和黄淮种植区不同叶位的烟叶δ13C 值均显著高于其余两地烟叶对应叶位的δ13C 值，而西南和黄淮两个种植区相同叶位的δ13C 值无显著性差异。东南种植区上部、中部和下部叶片的δ13C 值在4 个种植区中均为最小值。4个种植区的烟叶δ13C值均随叶位的升高而增大，下部叶片的δ13C 值较小，且同一地区不同叶位的δ13C 值有显著性差异。这可能是由于土壤呼吸所释放的CO2的δ13C 的平均值为-12‰～-25‰，而大气中CO2的δ13C 平均值为-7.8‰，两者之间存在较大差异，而靠近土壤的叶片较多的吸收更负的δ13C 值的CO2源，其δ13C 值减小，因此即使生长在同一地区同一环境的烟叶，因CO2来源不同，不同叶位的烟叶内部碳同位素组成也不同［22-23］。δ13C 值同时也表征了植物叶片在光合作用活跃期的平均光照状况，该值偏低，说明叶片在生长期接收光照较少，由此可以推断烟叶上部叶片获得的光照多于下部叶片，因而其叶片碳同位素组成高于下部叶片［4,24］。

图3 4 个一级种植区烟叶δ13C 值随叶位的分布Fig.3 Distribution of δ13C values of tobacco leaves with leaf position in four first class planting areas

2.3 稳定碳同位素对烟叶的聚类分析

我国烤烟类型按照烟叶香型可以分为清甜香型、蜜甜香型、醇甜香型、焦甜焦香型、焦甜醇甜香型、清甜蜜甜香型、蜜甜焦香型、木香蜜甜香型等八大香型［25］。通过对不同产地不同香型烟叶的δ13C 值进行聚类分析（图4）发现，当聚类距离＜5 时，样本可以被分为三类：第一类为高δ13C 值，清香甜香型烤烟：临沧烤烟、曲靖烤烟、玉溪烤烟、大理烤烟、昆明烤烟、保山烤烟、楚雄烤烟；第二类为较高δ13C 值，焦甜焦香型、清甜蜜甜香型和焦甜醇甜香型：渭南烤烟、铜川烤烟、南平烤烟、三明烤烟、龙岩烤烟和抚州烤烟；第三类为较低δ13C 值，焦甜醇甜香型、醇甜香型和蜜甜香型：韶关烤烟、郴州烤烟、湘西烤烟、安康烤烟、商洛烤烟、汉中烤烟、贵阳烤烟、遵义烤烟。当聚类距离＜2 时，醇甜香型烤烟可单独被分为一类为低δ13C 值：湘西烤烟、安康烤烟、商洛烤烟和汉中烤烟。

图4 基于不同产地烟叶的δ13C 值聚类结果Fig.4 Cluster results of tobacco leaves from different areas based on δ13C values

3 讨论

植物碳同位素组成受多种生物因素和非生物因素的影响［2］，虽然植物组织内的δ13C 值最终由生物因素决定，但生物因素受其生长地区环境因子的影响，因而植物的碳同位素组成蕴含其生理生态特征和环境信息［4］。烟草是一种适应性广且对生态环境条件十分敏感的经济作物，生态环境影响烟叶的品质和香型，烟草品质差异，“良由地气使然也”［26-27］。本研究发现，在99°17′E～118°26′E 范围内，烟叶δ13C 值与经度呈显著负相关关系，经度每增加1°，烟叶δ13C值减小0.09‰，这与李嘉竹［14］对陆地C3、C4 草本植物的研究结果一致；在23°88′N～35°53′N地区范围内，烟叶δ13C 值与纬度之间呈一种非线性关系，通过二次曲线进行拟合发现具有二次抛物线特征，即从整体来看烟叶δ13C 值表现出随纬度增加先下降后上升趋势。这与李嘉竹［14］研究的植物叶片碳同位素与纬度也呈负相关关系的结果不太相同，可能是由于烟叶δ13C 值受局部地区环境条件的影响。然而经度和纬度并非是导致烟叶δ13C 差异的根本原因，环境因素如光照、降水、温度、二氧化碳浓度等才是主要原因，不同经、纬度地区的气候条件和地理环境的差异导致烟叶碳稳定同位素组成差异。通过对同一区域内不同叶位烟叶δ13C 值研究发现，4 个种植区不同叶位烟叶δ13C 值具有显著差异，随叶位升高而增大，表现为上部叶片＞中部叶片＞下部叶片，且同一地区不同叶位的δ13C 值有显著性差异。这与王毅等［16］结论一致。西南种植区和黄淮种植区烟叶碳同位素组成较接近，显著高于其他两个种植区，而长江中上游种植区和东南种植区的烟叶碳同位素组成较类似。最后，本研究以δ13C 值为变量，对不同产地不同香型烤烟进行聚类分析发现，可以对清香甜香型和醇甜香型烤烟进行有效聚类，而对焦甜焦香型、清甜蜜甜香型、焦甜醇甜香型和蜜甜香型4 种香型烤烟则没有明显的聚类效果，需要加入其他变量如氮同位素等进行进一步研究。本研究初步探明烟叶碳同位素组成与经纬度、叶片以及烤烟香型的关系，但烟叶δ13C 值与烤烟品质、香气成分之间关系及对其生理指标的关系还有待进一步深入研究。

4 结论

本研究分析了烟叶碳同位素组成与地理空间要素之间的关系，并利用碳同位素对不同香型进行烟叶聚类分析，烟叶稳定碳同位素组成与经度呈负相关关系，经度每增加1°，烟叶δ13C 值减小0.09‰；与纬度整体呈以北纬27°50′为谷底的“V”字型变化特征，拟合后呈二次抛物线关系，不同叶位烟叶稳定碳同位素组成不同，利用δ13C 值可以对清香甜香型和醇甜香型烤烟进行有效聚类。