基于网络药理学探析四妙散对于滑膜炎治疗的潜在作用机制

王俊峰，关雪峰，杨永菊，张宇鹏，王 群

（1.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847；2.辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032）

滑膜炎是指滑膜组织受到急性创伤或慢性劳损等刺激引起的无菌性炎症，在临床中患者多表现为关节疼痛、肿胀、活动障碍等症状［1］。据统计，在我国滑膜炎的发病率很高约为7. 6%［2］。现代医学对于滑膜炎治疗主要采取口服非甾体抗炎药及关节腔穿刺抽液治疗，虽短时疗效较好，但病因未除，仍会反复发作迁延不愈，严重影响患者日常生活［3］。传统医学中认为滑膜炎的发病是由于本体气血亏虚，复感风寒湿之邪，致使邪气入里化热，流注于关节而引发的，其中湿热内蕴是本病发病的根本，治法应以清热利湿为主［4］。

四妙散首载于清代张秉成的《成方便读》，具有清热利湿，舒筋壮骨的功效，方由苍术、黄柏、牛膝、薏苡仁四味药物组成，苍术寒凉苦燥以除湿邪之来源；黄柏辛苦而温走下焦以除肝肾之湿热；薏苡仁入阳明胃经祛湿热而利筋骨；牛膝补肝肾兼领诸药之力以直入下焦，四药合用对于湿热下注的疾病治疗效果显著［5］。现代药理研究发现苍术的主要活性成分为倍半萜类、烯炔类、三萜及甾体类等化合物，具有抗炎、抗病毒等作用，尤以对类风湿性关节炎的疗效显著［6］；黄柏的主要化学成分为生物碱、黄酮类、甾醇类化合物，可以抗氧化、抑制细胞免疫反应［7］；而牛膝主要为甾酮类、皂苷类和多糖类化合物，具有促进软骨修复，抗脂质过氧化等作用［8］；薏苡仁主要活性成分包括酯类、不饱和脂肪酸类、糖类及内酰胺类等，具有镇痛、抗炎、增强免疫的作用［9］。近来有研究表明四妙散可以通过抑制家兔血清中IL-1β 和TNF-α 的表达，达到治疗创伤性滑膜炎的作用［10］。在探究四妙散对滑膜炎的治疗效果中，刘晗等［11］研究发现四妙散不仅可以明显降低滑膜炎患者外周血中炎性因子的表达水平，还可以降低致痛介质前列腺素及NO、5-羟色胺的表达水平，证实了四妙散具有明显的抗炎、镇痛效果。

网络药理学是基于大数据时代背景下的新兴研究方法，基于系统生物学理论，通过利用多种网络数据库和计算机软件，构建“中药-基因-疾病”的关系网，为中药复方潜在活性成分与作用靶点的研究提供指导［12］。本研究基于网络药理学方法探究四妙散对于滑膜炎治疗的潜在作用机制，以期对四妙散的临床应用及滑膜炎疾病的临床研究提供相应的参考。

1 材料与方法

1.1 关键活性成分收集

以“苍术、黄柏、牛膝、薏苡仁”为关键词在TCMSP 系统（http：//Lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）中查找以上四味药物的组成成分及药物所含化学成分信息。按照口服生物利用度（OB）和药物相似度（DL）筛选牛膝关键活性成分。口服生物利用度是指制剂中药物被吸收进入人体循环的速度和成度，药物相似度是指化合物与已知药物的相似性，这两者对于判断药物的活性成分具有重要意义，本研究根据以往研究，以OB≥30%，DL≥0.18 作为筛选药物关键活性化合物的标准。

1.2 构建四妙散化学成分-靶点基因-滑膜炎疾病的网络

通过TCMSP 数据库查找苍术、黄柏、牛膝、薏苡仁化学成分的蛋白作用靶点，采用Uniprot 数据库（https：//www.uniprot.org）查 询 蛋 白 所 对 应 的 基因，进行归纳总结，得到四妙散关键活性化合物基因。同 时 借 助Genecards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//omim.org/）和DisGeNET（https：//www.disgenet.org/）等数据库，以“synovitis”为关键词检索出与滑膜炎疾病相关的基因。并将得到的四妙散关键活性化合物基因和滑膜炎疾病基因结果输入在线韦恩图平台（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）获得交集基因和韦恩图，并利用Cytoscape 软件构建可视化图片。

1.3 PPI 网络构建

PPI 网络为蛋白相互作用网络，其可以反映蛋白之间相互作用关系。将四妙散与滑膜炎疾病共同作用靶点基因导入string 软件中（https：//string-db.org/），物种选择Homo sapiens，隐藏游离蛋白，并下载PPI 蛋白互作关系图，筛选前30 个PPI网络核心基因，绘制柱状图。

1.4 相关信号通路网络构建

采用R 语言的Bioconductor 生物学数据包进行基因GO 功能和KEGG 通路富集分析，根据统计学意义，设置P值为0.05，Q值为0.05 进行GO 生物学富集分析和KEGG 通路富集分析，输出结果并绘制barplot 柱状图和气泡图，最后分析结果讨论四妙散对于滑膜炎的治疗机制。

2 结果

2.1 活性化合物的筛选

利用TCMSP 数据库按照OB≥30%，DL≥0.18 的标准进行筛选，得到四妙散的活性化合物75个，其中苍术9 个，黄柏37 个，牛膝20 个，薏苡仁20个，剔除重复化合物共得到64 个关键活性化合物，包括巴马汀、原藜芦碱、四氢小檗碱等成分。选取前20 个活性化合物，按照OB 值的由大到小排序，见表1。

表1 四妙散前20 个关键活性化合物成分Tab 1 Top 20 key active compounds of Simiao powder

2.2 四妙散活性化合物靶点与滑膜炎疾病靶点交集基因

通 过Genecards、OMIM 和DisGeNET 等 数 据库搜索与滑膜炎相关的靶点基因共884 个，将四妙散与滑膜炎的靶点基因导入Excel 中获得四妙散-滑膜炎的共同靶点，利用在线韦恩图平台绘制韦恩图，记录共同靶点所对应的滑膜炎关键化合物，剔除无关化合物。最终得到与四妙散-滑膜炎相关的关键化学成分37 种，四妙散-滑膜炎的共同靶点71个。见图1。

图1 四妙散-滑膜炎交集基因韦恩图Fig 1 Venny diagram of Simiaosan-synovitis intersection genes

2.3 药物-疾病靶点可视网络构建

将2.2 中获得的交集基因和37 种关键化合物导入Cytoscape 软件中，构建药物-疾病可视化网络，网络中共110 个节点（71 个基因，37 个关键化合物，1个疾病名称，1 个药物名称），其中紫色三角表明37种关键化合物成分，活性化合物包括甾体类、黄酮类等化学种类。蓝色菱形代表71 个交集基因。在上述网络中，每一个节点的度值表示药物-疾病网络图中的节点之间相连的路线的条数。节点的度数越大代表其越有可能成为网络中的中枢节点。从化学成分来看，度数排名在前四的为：槲皮素（quercetin）56）、山 奈 酚（kaempferol）（23）、汉 黄 芩 素（wogonin）（21）、黄芩素（baicalein）（15）。从靶点的角 度，度 数 前 四 的 分 别 为PTGS2、PTGS1、AR、PGR，其分别可以与28、21、16、15 个化合物发生作用。在根据以上的网络的拓扑学性质进行分析中，可以发现四妙散的关键的化合物可以对多个靶点具有调控作用，这种调控作用体现了药物靶点的多样性及生物网络的协同性。见图2 及表2。

表2 四妙散治疗滑膜炎交集基因Tab 2 Intersection genes of Simiao powder in treatment of synovitis

图2 四妙散-滑膜炎可视化网络Fig 2 Simiaosan-synovitis visualization network

2.4 蛋白质相互作用核心网络（PPICN）的构建与筛选

将2.2 中获得71 个交集基因输入string 软件中得到图3，其中节点代表相关蛋白，每条边代表蛋白与蛋白相互作用关系，边数越多的蛋白表明其是核心蛋白的可能性越大，选取排名靠前的30 个蛋白构建柱状图如图4，前30 个蛋白名称分别为：JUN、AKT1、MAPK1、RELA、FOS、IL6、MAPK14、ESR1、VEGFA、EGFR、CXCL8、IL1B、MAPK8、MYC、STAT1、CASP8、CCND1、PRKCA、BCL2、BCL2L1、CASP3、CCL2、EGF、IL2、IFNG、NFKBIA、CXCL2、FN1、IL10、NOS3。这些蛋白对于滑膜炎的治疗起着关键的作用。

图3 四妙散-滑膜炎蛋白相互作用核心网络Fig 3 Core network of interaction between Simiaosan-synovitis proteins

图4 核心蛋白柱状图Fig 4 Core protein histogram

2.5 生物学（GO）富集分析结果

GO 富集分析结果共得到90 条GO 生物学富集过程，按照富集基因数目排名，排名靠前的主要为：细胞因子受体结合（CASP3/CCL2/CD40LG/CXCL10/CXCL11/CXCL2/CXCL8/IFNG/IL10/IL1A/IL1B/IL2/IL4/IL6/STAT1/TNF/VEG -FA），受 体 配 体 活 性（CCL2/CD40LG/CXCL10/CXCL11/CXCL2/CXCL8/EGF/IFNG/IL10/IL1A/IL1B/IL2/IL4/IL6/SPP1/TNF/VEGFA），细胞因子活性（CCL2/CD40LG/CXCL10/CXCL11/CXCL2/CXCL8/IFNG/IL10/IL1A/IL1B/IL2/IL4/IL6/SPP1/TNF/VEGFA），DNA 结合转录激活活性（AR/ESR1/FOS/HIF1A/JUN/MYC/NFATC1/NR1I2/NR3C1/PGR/STAT1/TP53） ，生长因子受体结合（EGF/IL10/IL1A/IL1B/IL2/IL4/IL6/VEGFA），前20 位GO 生物学过程富集分析，见图5。通过GO 生物学富集可以看出四妙散通过多种生物学调控达到治疗滑膜炎的效果。

图5 四妙散活性成分治疗滑膜炎关键靶点的GO 生物学过程富集分析barplot 柱状图Fig 5 Barplot histogram of GO biological process enrichment analysis of key targets of Simiao powder in treatment of synovitis

2.6 靶点通路分析（KEGG）

通过KEGG 得到四妙散治疗滑膜炎关键靶点基因主要富集在142 条通路（P＜0.05），提取前20个信号通路绘制barplot 柱状图和气泡图，见图6、7。在142 条信号通路中与滑膜炎关系密切的有32 条信号通路，根据P值由小到大的排序绘制表3，表中涉及IL-17 信号通路、TNF 信号通路、T 细胞受体信号、Toll 样受体信号通路等多种信号通路。这表明四妙散治疗滑膜炎涉及不同信号通路的调控，且信号通路相互关联，这体现了信号通路的协同发挥作用。

图6 四妙散治疗滑膜炎关键靶点富集信号通路barplot 柱状图Fig 6 Barplot histogram of signal pathway of key target enrichment of Simiao powder in treatment of synovitis

图7 四妙散治疗滑膜炎关键靶点富集信号通路气泡图Fig 7 Bubble chart of signal pathway enriched by key target of Simiao powder in treatment of synovitis

表3 四妙散与滑膜炎相关信号通路Tab 3 Signal pathways of Simiao powder and synovitis

3 讨论

滑膜炎在传统医学中归属于“骨痹”“筋伤”等范畴。《素问·生气通天论》中指出：“湿热不攘，大筋软短，小筋弛长，软短为拘，弛长为痿”。《素问·至真要大论》中也提到：“诸胀肿大，皆属于热；……诸病胕肿，疼酸惊骇，皆属于火。”［13，14］。本病病机在于湿热闭阻，治法以清热利湿，舒筋通络为主，现代医学认为滑膜组织中大量炎性细胞浸润及滑膜细胞过度增殖是滑膜炎的主要病理特征，滑膜炎的发病也常常与骨性关节炎和类风湿性关节等疾病关系密切［15］。

本研究基于网络药理学探讨四妙散对于滑膜炎治疗的潜在作用机制，通过检索TCMSP 数据库得到四妙散关键化学成分64 个，参与调节四妙散-滑膜炎相关的关键化学成分37 个，且度数在前四位的槲皮素、山奈酚、汉黄芩素和黄芩素均为黄酮类化合物。现代药理学发现黄酮类化合物具有具有良好的抗炎、抗氧化、镇痛作用，可以对骨关节损伤类疾病具有良好的治疗效果［16］。从靶点角度来看，排名靠前的为PTGS2（COX-2）和PTGS1（COX-1），二者均为前列腺素生成的主要限速酶。王凤龙等［17］研究证实滑膜炎患者滑膜细胞培养的上清液中存在前列腺素过度表达情况，且通过药物抑制前列腺素的表达，可以明显改善滑膜细胞的炎性状态［18］。AR 为雄激素受体，在网络中共与16 个活性成分有关，现代研究表明，在炎症期间低水平的雄激素会促使芳香化酶合成，芳香化酶会诱导雄激素转换成雌激素，进而激活滑膜成纤维细胞，加重滑膜增生［19］。PGR 为孕激素受体，至少与15 个活性成分相关，以上四者均为四妙散的靶标核心。通过可视化网络可见四妙散是通过多途径多靶点发挥作用，并具有多种潜在作用机制。

PPI 是表明蛋白与蛋白相互作用关系的网络，研究得到PPI 网络中与炎性反应蛋白居多，其中JUN、MAPK1、AKT1、IL6、MAPK14 等均与滑膜细胞的炎性反应有关，据此推测四妙散主要通过改善滑膜细胞的炎性状态，达到治疗滑膜炎疾病的作用。此外PPI 网络也尚与细胞凋亡、微循环等有着密切的联系，这也为探究药物的作用机制提供了相应的参考。

GO 生物学富集过程提示滑膜炎的治疗与细胞因子受体结合和细胞因子活性密切相关，且主要抑制炎性基因酶活性，完成细胞修复与再生，这与PPI得到的结果相吻合。通过KEGG 信号通路富集分析，得到32 条与滑膜炎治疗相关的信号通路，其中包括炎性反应、细胞凋亡、微循环等多方面。（1）炎性反应：富集数目最多的为IL-17 信号通路，Th17细胞主要分泌IL-17，IL-17 是一种促炎细胞因子，主要通过诱导破骨细胞和基质金属蛋白酶生成，加重关节滑膜炎症及关节畸形［20］。TNF 是一种炎性反应介质，不仅可以诱导前列腺素胶原酶的分泌和滑膜细胞合成加重炎性反应过程，还可以与TNFR1受 体 结 合，激 活NF-κB 与p38 信 号 通 路［21，22］。在 炎性反应中，Toll 样受体信号通路可与NF-κB 信号通路发生协同作用，两者可以共同促使滑膜细胞异常增生［23］。MAPK 信号通路是一种信号转导酶系统，当受到外界刺激后，会激活MAPK 信号通路释放转录活化因子，引起MAPK 逐级磷酸化，促使ERK 参与细胞的增值与分化，p38 参与炎性反应的表达［24-35］。Wnt 信号通路是调节细胞增殖分化的重要通路之一，实验性阻断Wnt 信号通路，可以有效降低滑膜细胞中白细胞介素和RANKL 的表达，也有相关研究表明Wnt 信号通路可以对破骨细胞的分化具有重要的调节作用［26］。（2）抗氧化损伤：FoxO信号通路可以调控细胞的增殖和氧化应激反应。FoxO 具有4 个同源基因，其中与滑膜细胞关系最为密切的是FoxO3a，俞晨等［27］研究发现通过药物促进FoxO3a 的表达，可以有效提高成纤维滑膜细胞的抗氧化应激能力。（3）细胞凋亡：主要与JAK-STAT 信号通路有关。研究发现炎性介质IL-6 可以激活该信号通路，诱导STAT3 磷酸化，促使相关靶基因转录，产生基质金属蛋白酶，增加滑膜细胞抗性［28］。（4）微循环：在微循环中，PI3K-Akt、VEGF 与HIF-1 可 以 表 现 出 协 同 作 用，PI3K-Akt 通路激活可以促使组织细胞炎性反应增强，促使其下游底物mTOR 合成，mTOR 可以作为枢纽，调节下游目的基因VEGF、HIF-1 共同参与调控滑膜中新生血管生成［29］。Apelin 信号通路、脂肪因子及促炎因子等都可以加重骨性关节炎，而骨性关节炎是导致关节滑膜炎的另一诱因［30］。KEGG 信号通路富集中结果显示滑膜炎疾病治疗与类风湿性关节炎关系密切，这与目前已知的研究是相吻合的。

综上所述，四妙散主要通过影响炎性反应、细胞凋亡、微循环等途径干预滑膜炎。研究通过构建“中药-基因-疾病”网络对四妙散的关键活性成分以及靶标进行了预测，并将研究结果与已知实验结果进行对比，所得结果真实可靠，为后续的四妙散的临床应用及滑膜炎相关疾病基础与临床研究提供了数据支持。