基于网络药理学的柴胡在小柴胡汤中治疗发热的作用分析

王旭红，李耀辉，张军城，李 哲，刘改霞，张 涛，5，张暮盈

（1. 陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳 712046；2. 陕西省中医医院，陕西 西安 710000；3. 中国中医科学院中医药发展研究中心 北京 100700；4.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；5.安康市中医医院，陕西 安康 725000）

发热是指致热原作用于体温调节中枢导致体温中枢功能紊乱或者其他各种原因引起的产热过多、或伴随散热减少所引起的体温升高超过正常范围［1］。发热不是一个独立的疾病，而是其他多种疾病发生过程中所伴随的临床中最常见的症状，如感染、癌症以及免疫性疾病等［2-4］。引起该症状的具体机制尚不明确，但是学者认为发热是由外源性致热源与宿主受体结合后激活靶细胞，产生和释放内源性致热源，最终引起发热［5］。外源性致热源包括病原微生物、抗原抗体复合物、类固醇以及其他致炎物质，内源性致热原包括IL1β、IL6 和TNF-α 等细胞因子［6］。这些内源性致热源诱导发热的下游介质激活环氧合酶（COX-2）介导花生四烯酸酶促转化为前列腺素H2（PGH2），进一步导致前列腺素E2（PGE2）的产生，PGE2 是热反应的最终致热介质［7］。临床中最常用的解热镇痛药物布洛芬，其作用机制就是抑制COX2，减少前列腺素合成，通过下丘脑体温调节中枢而发挥解热作用。除西药外，临床中最常用的中成药退热剂就是柴胡注射液，常单用或与复方氨林巴比妥联用。

柴胡属于中药学解表药中的疏散风热药，其味苦、性辛微寒，归肝、胆、肺经，具有解表退热的功效［8］。《神农本草经》指出柴胡主心腹，去肠胃中结气……寒热邪气，推陈致新。《药性论》指出柴胡主时疾内外热不解，单煮服。《医学启源》指出柴胡除虚劳烦热，解散肌热，去早晨潮热。现代药理学研究表明柴胡具有解热、抗病毒、抗细菌内毒素、抗炎、抗肿瘤和提高免疫力的作用［9］。中药柴胡具有多种有效成分，每种成分所对应的靶点较多，该药对多种疾病都有治疗作用。目前已发表的文献中基于网络药理学方法介绍了小柴胡汤治疗发热的作用机制，但是通过对symmap 数据库（https：//www.symmap.org/search/）进行检索发现小柴胡汤中对发热有效的中药仅有柴胡一味，而且临床中也广泛的使用柴胡注射液治疗发热。为进一步阐释柴胡干预发热的作用机制，本研究基于网络药理学方法从数据库中提取药物和疾病的靶点，对靶点进行分析从而得出柴胡治疗发热的关键靶点及其可能的作用通路。

1 材料与方法

1.1 柴胡的靶点预测

首 先 利 用TCMSP 数 据 库（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）检索小柴胡汤中所有药物的有效成分和靶点，然后利用Uniprot 数据库（https：//www.uniprot.org/）对收集到的化合物对应的靶点信息进行标准化处理，最后删除重复的化合物和靶点信息。本研究为了更加全面的分析柴胡的作用机制，不采用任何ADME 参数对有效成分进行筛选，将检索到的有效成分和靶点信息全部纳入后续分析。

1.2 发热的靶点预测

利用OMIM 数据库（https：//omim.org/search/advanced/geneMap）、disGeNET 数 据 库（https：//www. disgenet. org/search）、GeneCards 数 据 库（https：//www.genecards.org/）和symmap 数据库，并以“Fever”为关键词进行检索。将上述多个数据库的靶点进行汇总，并删除重复的靶点即可得到疾病的靶点。最后采用R 3.6.3 将柴胡的靶点与发热的靶点进行映射，得到的交集靶点被认为是核心靶点。

1.3 蛋白互作网络构建

以HINT 数据库（http：//hint.yulab.org/）所下载的蛋白相互作用网络为背景，利用Cytoscape 3.6.0 完成蛋白互作网络构建。其中HINT 数据库是由8 个相互作用组资源（BioGRID、MINT、iRef-Web、DIP、univent、HPRD、MIPS 和PDB）的高质量蛋白质相互作用汇编，课题组成员手动地过滤以消除错误的和低质量的相互作用，并且保持实时更新。

1.4 核心靶点的GO 富集分析和KEGG 富集分析

采用R 3.5.3 软件bioconductor 程序包给关键靶点名称转换为ID，然后再利用bioconductor 程序包对转换后的ID 进行GO 富集和KEGG 富集，在输入的命令中按照P＜0.05，Q＜0.05 进行GO 富集和KEGG 富集过程的筛选。

2 结果

2.1 柴胡有效成分及靶点预测

利用TCMSP 数据库进行重要有效成分和靶点的提取，共得到小柴胡汤有效成分726 种，其中柴胡有效成分215 种。红色部分表示柴胡的有效成分，蓝色部分表示小柴胡汤的有效成分，见图1。将有效成分对应的靶点采用Uniprot 数据库进行标准化，并删除重复的靶点，共得到小柴胡汤靶点677 种，柴胡靶点516 种。红色部分表示柴胡的靶点，蓝色部分表示小柴胡汤的靶点，见图2。

图1 药物有效成分图Fig 1 Effective components of drugs

图2 药物靶点图Fig 2 Drug target map

2.2 发热靶点及核心靶点预测

通过对1.2 中四个疾病数据库进行检索，将检索结果进行汇总并删除重复的靶点后共得到疾病靶点7 305 个。然后利用R 软件VennDiagram 程序包对柴胡的靶点、小柴胡汤的靶点以及发热的靶点取交集，最终得到交集靶点400 个，它们可能是治疗发热的核心靶点。紫色部分为发热的疾病靶点，绿色部分为小柴胡汤的靶点，黄色部分为柴胡的靶点，重叠的部分为交集靶点，见图3。

图3 靶点Venn 图Fig 3 Venn diagram of target

2.3 蛋白互作网络构建

以HINT 数据库中的蛋白互作关系为背景网络，共有12 190 各节点，64 120 条边；首先将小柴胡汤的靶点影射其中并选中与邻近靶点的关系，共得到3 906 个节点，28 232 条边；再将柴胡的靶点影射其中，共得到380 个节点，369 条边；最后将2.2 中所得交集靶点影射其中共得到310 个节点，322 条边。见图4。对PPI 网络进行拓扑分析，结果发现GAPDH、AKT1、INS、IL-6、VEGFA 等 节 点 连 接 度 较高，可能核心靶点。将所得到的的310 个节点映射到柴胡的靶点中，逆向寻找重要的化合物，按照节点度值＞4 进行化合物和靶点的筛选，从图中可以看出最重要的化合物为槲皮素（quercetin）、醋酸（acetic acid）以及葛根素（puerarin），重要的靶点为PTGS2、GABRA1、NCOA2 和ADH1B。见图5。

图4 PPI 网络Fig 4 PPI network

图5 柴胡治疗发热的重要靶点和化合物Fig 5 Important targets and compounds of Bupleurum

2.4 GO 富集分析和KEGG 富集分析

在2.2 和2.3 的结果中分别的到两个交集的靶点，但是2.3 中结果是基于HINT 数据库中的高质量蛋白互作关系，因此为了使本研究结果更加可靠，GO 富集分析和KEGG 富集分析采用2.3 中所得到的PPI 网络中的靶点为基础。采用R 软件bioconductor 程序包进行GO 富集分析，结果显示共富集为185 个有显著意义的条目，其中辅因子结合（cofactor binding）以及辅酶结合（coenzyme binding）明显优于其他的富集条目。见图6。KEGG 富集结果共分为177 个有显著意义的条目，主要涉及EB 病毒感染、乙型肝炎等感染相关的信号通路，前列腺癌、膀胱癌、肺癌等癌症相关的通路，内分泌抵抗、同种异体排异反应等代谢相关的信号通路。见图7。

图6 GO 富集分析Fig 6 Go enrichment

图7 KEGG 富集分析Fig 7 KEGG enrichment

3 讨论

发热是感染科和呼吸科最常见的疾病，发热的原因也是多种多样的，其中有感染因素引起的，也有非感染因素引起的［10］。不同因素导致的发热都以针对病因治疗为主，但是对于一些不明原因的发热或者发热早期病因尚未明确时多以对症治疗为主［11］。临床中常用的退热剂包括口服布洛芬，肌肉注射安痛定或者肌肉注射柴胡注射液，在低至中度发热时，尤其是在胃部不适的患者中中成药柴胡注射液使用较为广泛，在高热以及超高热时柴胡注射液联合安痛定注射液使用更加广泛［12］。柴胡自古以来就被用于各种发热性疾病的治疗，如《伤寒论》小柴胡汤、《伤寒六书》柴葛解肌汤等，对于本次新型冠状病毒疫情发热的文献可以看出基于网络药理学的小柴胡汤分析发现，小柴胡汤对于发热症状具有较好的疗效［5］。而本研究前期针对小柴胡汤采用symmap 数据库检索对发热具有治疗作用的中药，最后发现该方中仅有柴胡一味中药具有干预发热的作用，通过临床实践及文献研究发现在多个治疗发热的方剂中柴胡有着举足轻重的地位。因此，本研究基于网络药理学方法详细的探讨柴胡的解热机制。

首先，本研究采用TCMSP 数据库提取小柴胡汤及柴胡的有效成分及靶点，其中柴胡的有效成分约占小柴胡汤所有有效成分的1/3，但是柴胡的靶点却约占小柴胡汤作用靶点的2/3。通过核心靶点逆向推到重要的化合物，可看出醋酸、槲皮素、葛根素为节点度值最高的化合物，重要的靶点为PTGS2、GABRA1、NCOA2 和ADH1B。其中醋酸作为一种复合调味料，现代药理学研究也认为其具有良好活性的抗微生物制剂，因为它能够降低微生物存活所必须的PH 值［13］；槲皮素是一种黄酮类化合物，现代研究认为该成分具有抗氧化、抗病毒、抗炎、抗肿瘤及免疫调节作用［14］；葛根素属于异黄酮类衍生物，现代药理学认为其具有抗炎、抗氧化及抗肿瘤的作用［15］。前列腺素内过氧化物合酶（PTGS）又称环氧合酶，是前列腺素生物合成的关键酶，PTGS 有两种同工酶：组成型PTGS1 和诱导型PTGS2，它们对表达和组织分布的调节不同，其中PTGS2 负责炎症前列腺素的产生，PTGS2 的上调还与细胞黏附增加、表型改变、抗凋亡和肿瘤血管生成有关。发热是由外源性致热源（细菌、病毒等等）与宿主受体结合后激活靶细胞，产生和释放内源性致热源，最终引起发热［16］。而通过靶点反向寻找的化合物中节点度值较高的三个化合物，对于细菌、病毒等外源性致热源均有不同程度的抑制作用；PTGS2 负责前列腺素的产生，而前列腺素是导致发热的重要介质，因此这些化合物和靶点在柴胡发挥解热作用中的主要成分和靶点。

然后，对核心靶点的PPI 网络进行拓扑分析GAPDH、AKT1、INS、IL-6、VEGFA 是网络中的核心节点，GAPDH 编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶蛋白家族的一个成员，它能执行机械上不同的功能，该蛋白质具有对大肠杆菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌具有抗菌活性［17］。AKT1 编码的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶以抑制细胞凋亡，而后磷酸化并使凋亡机制的组成部分失活［18］。IL-6 编码的蛋白质被证明是一种内源性热原，能够在自身免疫性疾病或感染患者中引起发热［19］。VEGFA 在血管生成以及内皮细胞生长中的发挥重要作用，能够诱导内皮细胞增殖、细胞迁移，抑制细胞凋亡，诱导血管通透性增加［20］。核心靶点的KEGG 富集分析结果显示靶点多数均富集在感染、癌症、免疫性性疾病相关的通路，也从另一方面表明柴胡可能对多种疾病引起的发热过程均有治疗作用。

综上所述，柴胡有效成分及靶点的现代药理学研究显示该药物具有抗感染、抗肿瘤以及免疫调节作用，而且柴胡及发热的交集靶点所构建的PPI 网络中节点度值前五的靶点中四个与炎症及肿瘤密切相关，所富集的通路中多数也与感染、肿瘤及免疫性疾病密切相关。因此，柴胡可以通过多靶点、多维度发挥发热的作用。