基于非标记核酸适配体荧光法检测灌溉水中汞离子的研究

王 楠，陈佳祎，陆安祥，栾云霞，卢静华

（1.锦州医科大学 药学院，辽宁 锦州121001；2.北京农业质量标准与检测技术研究中心，农业部农产品质量安全风险评估实验室（北京），农产品产地环境监测北京市重点实验室，北京100097）

随着新型现代农业的发展，农田生态环境和保障农产品质量安全在农业产业升级中的地位愈加重要，也对有毒危害因子的检测提出了更高的要求。高灵敏度、高通量且操作简单、成本低廉的快速检测方法更符合基层快速筛查的需求。重金属对农田环境的污染可通过农产品对人类健康造成严重危害，尤以汞、镉、铅、铬等毒性为最大［1］。这些重金属及其化合物多数有致畸、致癌作用，并且均为蓄积性毒物，具有生物不可降解性，归宿于水体、底泥、生物群或大气。在有毒金属元素中，汞的毒性排在首位，即使在浓度很低的情况下，也会对人类和动植物产生相当大的毒害作用。对农田土壤、空气、水体等环境介质以及农产品中的汞进行日常监测已成为各国的常规项目，因此，研究快速、低成本、灵敏度高且特异性好的汞离子检测方法显得极为重要［2－3］。汞的检测常采用原子吸收光谱法、原子荧光光谱法、色谱法等，但传统方法所需仪器价格昂贵，对操作人员、实验环境、前处理均有较高的要求，不适合在基层现场实时在线检测。基于免疫学原理的快速检测方法是目前现场检测的主流，但因抗体制备过程及其自身的特点，该法对于毒性强、免疫原性差、免疫位点不明的小分子污染物，存在杂交瘤细胞筛选难度大、抗体亲和力低、假阳性高等问题。近年来基于功能核酸对汞的检测有了新的突破，并在此基础上发展了比色法、电化学、共振瑞利散射、电致发光等快速检测技术，成为汞环境分析中的研究热点［4－8］。核酸适配体（Aptamer）是一段能够与靶分子高亲和力、高特异性结合的单链寡核苷酸，具有检测灵敏度高、成本低、易合成修饰等优点，在基础研究、分子诊断以及农产品及农田环境污染物监测等诸多领域中均展示出广阔的应用前景，为农产品和农田环境中化学残留物、生物毒素、重金属等小分子污染物的检测提供了一种新型、高效、快速的检测元件，具有很大的应用潜力［9－15］。已有研究表明，Hg2+可被适配体DNA链中的胸腺嘧啶（T－T）选择性捕获，错配形成T－Hg2+－T发夹结构，且亲和力强于适配体DNA与其互补链的结合力［16］。基于此原理，一些荧光和电化学适配体传感器已经被成功开发用于Hg2+检测［4－7］。随着材料与光学技术的发展，荧光法检测发展迅速，快速中小型荧光分光光度计是目前最常用的一种高灵敏度检测仪器，非常适合现场实时快速监测。荧光法具有灵敏度高、结果准确度高、适合实时监测等特点，且适配体易被荧光染料修饰，是目前普遍采用的光学检测方法。但目前采用的将荧光染料标记到核酸适配体上的方法，可能影响DNA的高级结构构象及其与目标物的结合。因此，利用非标记适配体的荧光检测技术具有更好的发展潜力，在环境分析、农产品安全、体外诊断等痕量分析领域具有更大的应用空间。本研究拟以非标记的汞特异性核酸适配体为识别元件，结合高效的荧光染料检测溶液体系中不同浓度的汞离子，通过探索荧光信号的变化规律及各组分的配比，确定最佳的检测体系。同时对方法的精密度、准确性和特异性进行研究，并应用于灌溉水样品的检测，以期为在线实时监测灌溉水中汞的污染水平提供技术支持。

1 实验部分

1.1 仪器与设备

LS－55荧光光谱仪，美国PE公司产品；台式高速冷冻离心机器，Sigma公司产品；Millipore纯水机，美国Bedford公司产品。

1.2 试剂

重金属汞的适配体寡聚核苷酸序列和互补序列均在生工生物工程（上海）股份有限公司合成，HPLC纯 化。Hg2+适 配 体 序 列：5'-TTCTTTCTTCCCCTTGTTTGTT-3'，互 补 序 列：5'-AACAAACAAG GGGAAGAAAGAA-3'，用 含1 mmol/L MgCl2（pH 8.5）的10 mmol/L的PBS（pH 7.4）溶 液 进 行 稀释，-20℃保存。腺苷的特异性适配体序列：5'-ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGTA-3'，其互补序列：5'-ACCTTCCTCCGCAATACTCCCCCAGGT-3'。汞标准溶液以及用于特异性检测的砷、铅、镉、铬和钾元素标准溶液购自钢研纳克标准物质中心，PicoGreen荧光染料、Tris－HCl购自Sigma公司，其它试剂均购于上海化学试剂公司。实验所用试剂均为分析纯。

1.3 检测原理

基于适配体DNA对汞离子的特异性结合，并利用荧光染料PicoGreen对双链DNA pg级的灵敏度和嵌入双链后引发荧光强度急剧增加（1 000倍）的特性进行高灵敏度特异性检测。如图1所示，当溶液中存在汞离子时，适配体的构象发生变化，单链DNA“stem-loop”区域形成特定的立体结构，高特异性、高亲和力地与汞离子结合。随后，加入适配体DNA互补链cDNA和PicoGreen，互补链将与溶液中未结合目标物的游离适配体结合，形成双链DNA。由于PicoGreen不结合单链核苷酸，仅识别并结合双链DNA的螺旋沟，并发射出荧光信号［17］，因此，可通过对荧光强度的分析来测定目标物汞的浓度，且汞离子的浓度与荧光强度成反比。

图1 基于PicoGreen/适配体检测汞离子的原理Fig.1 Schematic of the PicoGreen/aptamer-based method for detection of Hg2+

1.4 荧光检测

取50 μL浓度为1 μmol/L的Hg2+适配体DNA，加入100 μL不同质量浓度（0、0.002、0.02、0.2、2、20、200 μg/mL）的Hg2+，混匀孵化20 min后，加入50 μL浓度为1 μmol/L的适配体DNA互补链，此时Hg2+的最终质量浓度分别为0、0.001、0.010、0.100、1、10、100 μg/mL，再加入PicoGreen。连续测定λex/λem=480 nm/530 nm处的荧光强度值IF（不含Hg2+的空白对照溶液荧光值为IF0），每分钟检测1次，持续检测25 min。

1.5 特异性检测

按照“1.4”检测体系和孵育时间，以As3+、Pb2+、Cd2+、Cr2+、K+作为干扰物，在相同条件下检测适配体对Hg2+和其他金属离子的选择特异性和灵敏度，金属离子质量浓度梯度为0、0.002、0.02、0.2、2、20、200 μg/mL。以无目标物和干扰物，只有适配体DNA的溶液为空白对照，通过荧光强度变化分析Hg2+适配体与其他干扰离子的结合情况，判断方法的特异性。

2 结果与讨论

2.1 反应条件的确定

为了获得更好的荧光信号，需对PicoGreen和适配体DNA（1 μmol/L）相互作用的时间进行优化。如图2所示，低质量浓度的Hg2+（0.002 μg/mL）在反应5 min时的荧光强度达到最大，之后随着PicoGreen的荧光衰退，荧光强度逐渐降低；更高质量浓度的Hg2+（200 μg/mL）在反应进行5 min后，荧光强度基本保持稳定。这说明前5 min适配体/Hg2+复合物与适配体/互补链DNA双链之间存在竞争，Hg2+浓度越高越具竞争优势，且适配体/Hg2+复合物的结合亲和力强于适配体/互补链DNA双链。因此，本实验选择5 min作为适宜的反应时间。

图2 不同汞离子浓度下荧光强度随时间的变化情况Fig.2 Changes of fluorescence intensity with time under different mercury ion concentrations

2.2 方法检出限

随汞离子浓度的升高，530 nm处的吸收峰强度逐渐降低，汞离子浓度的对数（lgcHg，x）和荧光比值IF/IF0（y）之间呈良好的线性关系：y=1.157 2－0.162 6x，r2=0.988。根据标准偏差斜率法［18］，获得本方法的检出限为0.38 ng/mL，线性范围为0.001～100 μg/mL，满足世界卫生组织对饮用水中汞离子的限量标准（1 ng/mL）要求［19］。

2.3 特异性分析

为了验证本方法对汞离子检测的特异性，以同浓度的As3+、Pb2+、Cd2+、Cr2+、K+为干扰物，在相同条件下检测适配体对Hg2+和其他金属离子的选择特异性，结果如图3所示。结果表明，加入0.02～200 μg/mL的Hg2+作为目标物时，检测体系的荧光变化率显著高于其他金属离子，而以As3+、Pb2+、Cd2+、Cr2+、K+离子作为目标物的溶液荧光强度变化很小。

图3 不同金属离子的相对荧光强度变化Fig.3 Changes in the relative fluorescence intensity with various metalions

另外，为了证明Hg2+适配体的特异性和其他寡核苷酸对检测体系的影响，选用与汞离子适配体相似，同样具有发夹结构的腺苷适配体及其互补链作为识别元件，对不同质量浓度（0、0.002、0.02、0.2、2、20、200 μg/mL）汞离子进行检测。发现汞离子的加入并未显著降低溶液的荧光值，进一步证明了本方法的特异性（图4）。上述结果表明本方法使用的适配体序列具有较好的选择性，基于此建立的Hg2+的检测方法具有较好的特异性。

图4 利用腺苷适配体对Hg2+进行检测的荧光结果Fig.4 Fluorescence detection results of Hg2+by aptamer of adenosine

2.4 灌溉水样品检测

以北京市郊区农业灌溉水作为水样，经原子荧光法未检出总汞。将Hg2+标准溶液加入到该水样中，获得不同Hg2+质量浓度（50、100、500 ng/mL）的灌溉水样，按照本方法所建体系进行测定，获得加标灌溉水样中Hg2+回收结果（表1），其回收率为95.2%～97.9%，相对标准偏差为2.3%～4.0%。虽然灌溉水基质中存在不同类型的干扰物，但采用本体系检测Hg2+的加标回收结果良好。结果表明，本方法适用于农田灌溉水中汞的检测，在水质的实时在线检测方面具有良好的应用前景。

表1 灌溉水样中添加Hg2+回收结果（n=3）Table 1 Recovery results of adding Hg2+in irrigation water samples（n=3）

2.5 方法对比

本研究建立的基于汞特异性适配体荧光法检测Hg2+的方法无需对DNA分子和荧光染料进行设计和修饰，可将合成好的单链寡聚核苷酸直接与荧光染料以及适配体互补链混合形成检测体系，对溶液中的Hg2+进行监测。与ICP－MS和原子荧光等方法相比，该方法线性范围宽，不使用强酸、强碱、强氧化剂和还原剂，具有操作简单、灵敏度高、特异性好、用时短（可在5 min内完成）的优势（表2），在现场实时监测方面有良好的应用前景。

表2 与已报道方法的比较Table 2 Comparison between this method and the reported methods

3 结论

本研究建立了一种基于汞特异性核酸适配体检测农田灌溉水中汞离子的实时在线监测方法，应用核酸染料PicoGreen可以嵌入双链DNA的特性，未对适配体进行任何修饰，保证了适配体的空间构象及其与目标物结合的特异性，通过检测溶液的荧光强度即可监测汞离子浓度。该方法线性范围为0.001～100 μg/mL，检出限达到0.38 ng/mL，对汞离子具有很好的特异性，在实际样品检测中表现出较好的线性和基质适应性，具有简单、快速、灵敏的特点，在现场快速检测和高通量实时监测中具有很好的应用前景。