顶空固相萃取/表面增强拉曼法对挥发性农药的快速检测研究

王翠萍，王 山，张 欢，王纯荣

（江西农业大学 食品科学与工程学院，江西 南昌330045）

我国是农业大国，为减少病虫害造成的损失，大部分农作物在生长过程中都不同程度地使用了农药，从而导致了日趋严重的农药残留问题。如2018年广州和慈溪发生的蔬菜农药残留事件，其中叶菜类农药残留超标率达25%以上［1］。目前，对具有一定挥发性的农药的快速检测已成为研究热点。如地虫磷作为大田作业常用的剧毒有机磷杀虫剂［2］，可通过皮肤、呼吸道或消化道3种方式进入人体，严重危害人类健康［3］。福美铁（二甲基二硫代氨基甲酸酯类农药）常用于果园杀菌。加拿大卫生部有害生物管理局（PMRA）依据毒理学建立的数据库表明：长期使用福美铁可能对人体产生较大危害［4］。因此，对地虫磷和福美铁的快速检测研究具有重要意义。

目前，挥发性农药的主要检测方法有气相色谱（GC）［5］、气相色谱－质谱法［6］、高效液相色谱－质谱联用技术（HPLC-MS）［7－8］等。GB 23200.113－2018［9］中地虫磷的检出限为0.1 mg/kg。张晶等［10］通过气相色谱得到福美铁的检出限为0.1 mg/kg。这些传统方法虽然分辨率较高，但操作复杂、费用高昂且耗时长。因此亟待建立一种对此类农药的快速、灵敏和简便的测定方法。

表面增强拉曼光谱（SERS）技术是基于拉曼光谱和纳米技术的高灵敏分析技术，能够反映有机分子的结构指纹信息，已发展成为灵敏的食品安全分析方法［11－15］。目前，已有采用SERS检测有机化合物的研究报道［16－18］，但未见通过金纳米膜顶空固相萃取挥发性农药并进行SERS检测的研究。

本文以金纳米薄膜作为SERS基底，通过顶空固相萃取农药并进行拉曼光谱检测；探讨了顶空固相萃取温度、时间、NaCl含量和pH值等对SERS光谱的影响，并对定量检测结果进行线性拟合分析，为顶空固相萃取/表面增强拉曼光谱法快速高效检测挥发性农药提供了一种新的方法。

1 实验部分

1.1 试剂与材料

不锈钢片（304，无锡万信金属制品有限公司）；氯金酸、浓盐酸、甲醇、丙酮、地虫磷和福美铁购于国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯；美汁源果粒橙购于江西农业大学超市；自来水取自当地。

1.2 仪器

DXR2型激光显微共焦拉曼光谱仪（美国赛默飞世尔科技有限公司）；SU8010型场发射扫描电镜（日本日立公司）；GC9790Ⅱ型气相色谱仪（福立分析仪器有限公司）。

1.3 金纳米膜的制备

取0.5 cm×0.3 cm不锈钢片，分别用蒸馏水和丙酮超声5 min，取出干燥，并置于60℃水浴中用浓盐酸浸泡15 min；取出后再分别用蒸馏水和甲醇超声5 min，取出干燥，立即放入0.075%的氯金酸溶液中浸泡3 h（反应方程式：Fe+［AuCl4］－=Fe3++Au+4Cl－），取出自然干燥。样品形貌特征使用场发射扫描电镜考察。金纳米膜的制备及农药的检测过程见图1。

图1 金纳米膜的制备及农药的检测Fig.1 Preparation of gold nanofilms and detection of pesticides

1.4 顶空固相萃取及表面拉曼光谱信号采集与数据处理

采用金纳米膜在一定温度下对农药顶空固相萃取15 min后，以激光显微共焦拉曼光谱仪采集信号。顶空瓶中的气体浓度通过气相色谱测定［9－10］。拉曼光谱仪采集参数：激光波长785 nm，激光能量5 mW，分辨率5 cm－1；单次采集曝光时间2 s，光谱采集范围500～2 000 cm－1。光谱数据采用TQ9.7软件进行二次处理。

2 结果与讨论

2.1 SERS基底的结构特征

图2 为氧化还原法制备的金纳米膜基底的扫描电子显微（SEM）图片，结果显示该金纳米膜表面颗粒均匀，具有大量潜在的“热点”［19］，具有作为SERS基底的潜力。

图2 金纳米膜的SEM图片Fig.2 SEM photos of gold nanofilm

2.2 地虫磷与福美铁的典型SERS光谱图

图3 为利用制备的金纳米膜对地虫磷和福美铁分别进行顶空萃取后得到的典型SERS光谱和分子结构图。地虫磷SERS光谱中1 636 cm－1和1 572 cm－1处的特征峰来自于苯环上C＝C基的伸缩振动；1 074 cm－1和1 023 cm－1处的特征峰来自于苯环上S—C的伸缩振动和C—H的形变；999 cm－1处的特征峰则来自苯环形变［20］。对于福美铁，1 506 cm－1处的特征峰来自CH3摇摆变形和C—N伸缩振动；1 381 cm－1处的特征峰来自CH3形变和C—N伸缩振动；1 146 cm－1处的特征峰来自CH3摇摆和C—N伸缩振动；938 cm－1处的特征峰来自CH3N和C—S的伸缩振动；554 cm－1处的特征峰来自C—S的伸缩振动［19］。这些特征峰指纹图谱可用于定性判断地虫磷和福美铁，其中以地虫磷在999 cm－1和福美铁在1 381 cm－1处的特征峰表现出较高的SERS光谱强度，因此选用这两个峰分别对地虫磷和福美铁进行进一步研究。

图3 地虫磷（A）和福美铁（B）的典型SERS光谱Fig.3 Typical SERS of fonofos（A）and ferbam（B）

2.3 金纳米膜的稳定性与均一性检测

图4 给出了福美铁（0.05 mg/L）对SERS基底的稳定性和均一性检测结果。图4A为15个基底上检测到的福美铁拉曼光谱瀑布图；图4B为福美铁在同一基底的15个位置特征峰（1 381 cm－1）处的拉曼光谱强度。由图4A可以看出，本法在15片金纳米膜上均可测得福美铁的3个主要特征峰，峰形和强度较稳定。图4B显示，同一金纳米膜上测得的福美铁特征峰（1 381 cm－1）强度变化的平均值在10%以内。以上结果说明该基底具有良好的稳定性和均一性。

图4 15个基底上福美铁的拉曼光谱图（A）及同一基底上的15个位置在1 381 cm－1处的拉曼强度（B）Fig.4 Raman spectra of ferbam measured on 15 substratums（A），and Raman intensity at 1 381 cm－1 at 15 locations of the same substratum（B）

2.4 金纳米膜的增强因子

增强因子（EF）是评价基底SERS性能的重要指标之一。为检测金纳米膜的拉曼光谱增强效果，分别以0.1 mg/L地虫磷和0.1 mg/L福美铁为探针，根据公式EF=ISERS/INormal×cSERS/cNormal计算增强因子［21］。INormal、ISERS分别为增强前后的特征峰强度，cNormal为农药溶液浓度，cSERS为基底表面空气中的农药浓度（即顶空装置内基底表面气体中的农药浓度）。根据公式计算出EF分别为1.5×104（地虫磷）和2.7×104（福美铁），显示较好的表面增强效果。

2.5 顶空萃取温度对农药SERS信号的影响

将地虫磷和福美铁在不同温度下顶空萃取，顶空温度分别为55～85℃、25～70℃，萃取时间15 min，两者的质量浓度均为0.05 mg/L。实验发现：在75℃之前，地虫磷的SERS信号随着温度的升高而逐渐增强，并在75℃达到最大值，当温度高于75℃后拉曼信号强度下降。在55℃之前，随着温度的升高，福美铁的拉曼信号逐渐增强，55℃时达到最大值，当温度高于55℃后拉曼信号逐渐下降。这可能是由于随着温度的升高，溢出更多的水蒸气，从而导致拉曼信号降低［22］。另外，福美铁在25℃下顶空萃取即能检测出拉曼信号，表明本法具有较好的应用前景。

2.6 顶空萃取时间对农药SERS信号的影响

考察了地虫磷（0.05 mg/L，75℃）和福美铁（0.05 mg/L，55℃）在不同顶空萃取时间（5～60 min）下的拉曼光谱图。发现顶空萃取5～15 min时，基底吸收量随着时间的增加而增加，15 min后由于基底吸收量已经达到饱和，受蒸气影响，吸附效果降低，导致SERS信号降低［23］。结果显示，顶空萃取仅5 min即可检测出拉曼信号，说明本方法较为灵敏。

2.7 NaCl含量及pH值对农药SERS信号的影响

NaCl可产生盐析作用，降低分析物在溶液的溶解度，使其更易挥发，添加适量的NaCl可以增强目标物的拉曼光谱检测效果［23］，因此对NaCl含量的影响进行考察。实验发现，随着NaCl含量增加，农药的SERS信号强度逐渐增强；NaCl含量为15%时，萃取效果最佳；之后随着NaCl含量增加，信号强度略有降低。

酸性环境会腐蚀不锈钢基底，因此考察了pH 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0时对SERS检测的影响。发现福美铁在pH 7.0时吸附效果较好，地虫磷则在pH 6.0时检测效果较佳。这是因为当溶液呈碱性时，会降低分析物的析出，顶空吸附效果变差［24－25］。

2.8 农药含量对SERS信号的影响及定量分析

考察了农药质量浓度和拉曼光谱强度之间的关系。图5显示，在一定农药质量浓度范围内，拉曼光谱强度随农药质量浓度的增加而增强。地虫磷在0.005～0.5 mg/L质量浓度范围内，可检测到1 074、1 023、999 cm－1处明显的SERS指纹图谱特征峰（图5A）。福美铁在0.005～0.1 mg/L范围内，可检测到1 381、938、554 cm－1处的特征峰（图5B）。图5C显示，地虫磷和福美铁混合液在0.01～0.5 mg/L范围内时，可检测到各自的特征峰。

图5 地虫磷（A）、福美铁（B）和地虫磷、福美铁混合物（C）的拉曼光谱图Fig.5 Raman spectra of fonofos（A），ferbam（B）and the mixture of fonofos and ferbam（C）headspace extraction time：15 min，NaCl content：15%；temperature：75℃（fonofos），55℃（ferbam）；pH：6.0（fonofos），7.0（ferbam）；the mixture of fonofos and ferbam：Vfonofos∶Vferbam=1∶1，ρfonofos∶ρferbam=1∶1

对地虫磷999 cm－1处的特征峰强度（y）与质量浓度（x）进行线性拟合，拟合方程为y=2.357 2x+75.942，相关系数R2为0.984 8。福美铁在1 381 cm－1处特征峰强度与质量浓度（x）的拟合方程为y=22.629x－109.68，相关系数R2为0.977 8。同浓度地虫磷和福美铁以等体积混合后，分别对999、1 381 cm－1处的特征峰进行定量分析，地虫磷和福美铁的拟合方程分别为yfonofo=1.277 4x+451.87，yferbam=1.883 9x+555.97，相关系数R2分别为0.926 0、0.984 9，均在0.9以上，说明线性良好。

根据检出限（LOD）计算公式［26］：LOD=3.3σ/S（其中σ为空白的标准偏差，S为校准曲线的斜率），计算得到地虫磷和福美铁的LOD均为5×10－3mg/L。

2.9 果汁及水中地虫磷与福美铁的检测

图6 是通过顶空固相萃取和浸泡两种方式对含有地虫磷和福美铁的水和果汁进行检测得到的拉曼光谱图。通过顶空固相萃取可以检测到0.005 mg/L的地虫磷（图6A）和福美铁（图6B）。浸泡法检测时，0.05 mg/L的地虫磷检测不到有效SERS信号，0.05 mg/L福美铁则可检测到有效SERS信号。浸泡法得到的SERS信号强度明显弱于顶空法。这可能是由于浸泡法检测时，果汁中其它组分对拉曼光谱信号造成干扰所致。两种农药混合后，检测结果类似（图6C）。无论在水还是果汁中，顶空萃取法都较浸泡法检测效果更佳。

图6 地虫磷（A）、福美铁（B）及混合液（C）检测的表面增强拉曼光谱图Fig.6 Surface-enhanced Raman spectra of fonofos（A），ferbam（B）and mixed solution（C）headspace extraction and dip time：15 min；temperature：75℃（fonofos），55℃（ferbam）

为验证本方法对地虫磷和福美铁检测的可靠性，对其进行加标回收实验。分别配制0.1、0.05、0.01 mg/L地虫磷及0.05、0.02、0.01 mg/L福美铁的加标果汁样品，每个加标水平进行3次平行试验。根据两者的线性拟合曲线计算出地虫磷在999 cm－1处，福美铁在1 381 cm－1处的回收率分别为93.3%～112%，92.5%～104%，相对标准偏差（RSD）分别为4.1%～5.2%和3.4%～6.5%。表明本法可有效用于地虫磷和福美铁的检测。

3 结论

本文以金纳米膜为基底，建立了顶空固相萃取技术结合SERS对挥发性农药（地虫磷和福美铁）进行快速检测的方法，对地虫磷和福美铁顶空固相萃取5 min即可得到拉曼信号；顶空萃取地虫磷和福美铁的优化条件为：NaCl含量15%、温度75℃（地虫磷）和55℃（福美铁）、pH 6.0（地虫磷）和pH 7.0（福美铁）。两者的LOD均为5×10－3mg/L。使用本方法对果汁中的地虫磷和福美铁进行检测，可检测到的两种农药的质量浓度均为0.005 mg/L。该方法操作简单，高效灵敏，在环境和食品安全快速检测方面具有良好的应用前景。相关研究为拉曼光谱在实际检测中的应用提供了新的思路。