混合菌群协同降解孔雀石绿及其产物分析

郝至纯，石先阳

(安徽大学 资源与环境工程学院 湿地生态保护与修复安徽省重点实验室，合肥 230601)

孔雀石绿(Malachite green)是一种广泛应用于木、丝、革等行业的三苯甲烷类染料。因采用孔雀石绿进行消毒操作方便，成本低，其在水产养殖业中的使用较普遍[1]。另一方面，孔雀石绿具有高残留和“三致”效应[2]，需对含孔雀石绿废水进行处理，以避免其对自然环境和生物造成严重和不可逆转的影响。物理化学法处理染料易导致二次污染，而生物处理法具有极好的环境兼容性且成本低。利用微生物对有毒染料废水进行无害化处理，是减轻其毒性的一种有效方法[3]。通过微生物的驯化和培养，筛选出对染料废水具有高效脱色性能的菌株。

混合微生物种群处理系统较纯菌株处理系统能更有效地降解污染物[4]，不同菌株在混合培养中的互补作用可提高其降解效率且混合菌可利用基质范围更广[5]。研究表明混合菌群对污染物的处理性能取决于系统中细菌菌群的多样性[6]。各菌株作用于染料分子的不同部分和基团时，有些菌株之间可形成共代谢机制[7]。如Pseudomonasaeruginosa、Ochrobactrumsp.和Providenciavermicola构成的混合菌群处理印染废水，16 h内COD去除率达95%[8]。中等嗜碱菌群分别处理含200 mg/L直接蓝151、直接红31的染料废水，5 d内脱色率分别为97.57%和95.25%[9]。另有研究证实混合菌群对本泽马黄S8-G、诺威克隆艳蓝FN-R和诺威克隆超级黑G的脱色率分别为65%、90%和90%[10]。然而混合菌群降解孔雀石绿的研究鲜见报道。

为实现孔雀石绿的降解，本研究通过分离高效微生物菌株，构建一组具有高效降解性能的混合菌群，协同降解孔雀石绿，考察不同因素对孔雀石绿脱色的影响，基于对降解产物的分析探讨混合菌群对孔雀石绿的降解机制，以期为混合菌群应用于实际染料废水的处理提供理论和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 污泥

污泥取自一个实验室运行的序批式间歇反应器。

1.1.2 培养基

无机盐培养基(g/L)：葡萄糖1.5，硫酸铵0.5，氯化钠1.0，磷酸二氢钾2.65，十二水合磷酸氢二钠4.26，七水合硫酸镁0.2；液体LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10；固体LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10，琼脂15～20。

1.1.3 染料

三苯甲烷类染料——孔雀石绿，购自国药集团化学试剂有限公司，其相对分子质量为364.92。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分离与鉴定

取适量污泥接种于含50 mg/L孔雀石绿的LB液体培养基中，在30 ℃、150 r/min条件下培养。待液体培养基完全脱色后，取脱色液稀释成10-5～10-7后涂布于含50 mg/L孔雀石绿的固体LB平板上，于30 ℃静置培养24 h后，挑取颜色较浅、形态不一的单菌落进行3～5轮的分离纯化后保藏。筛选出两株对孔雀石绿具有较强脱色能力的菌株，分别命名为JY-11和HCS77。使用SK8255试剂盒(上海生工)从细菌中提取基因组DNA，采用通用引物27F(AGTTTGATCMTGGCTCAG)和1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT)对细菌的16S rDNA序列进行PCR扩增，产物送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序；再与NCBI的数据库进行同源性的比较，通过MAGE 5.2软件构建系统发育树。

1.2.2 脱色实验

用无菌牙签挑取JY-11和HCS77(30 ℃固体LB培养基中培养1 d)单菌落，分别接种至0.5 mL液体LB培养基中，在30 ℃、150 r/min条件下培养8 h。待浑浊后，分别转至100 mL液体LB培养基中，在30 ℃、150 r/min条件下培养16 h。取OD600=0.5的J-H混合菌液(将JY-11和HCS77按浓度比1∶1进行混合，构建出J-H混合菌群)接种至50 mL无机盐培养基中，以JY-11、HCS77单菌和J-H死菌(95 ℃水浴灭活20 min)为对照，投加染料进行脱色实验。研究供氧条件(好氧、厌氧均设为150 r/min条件下反应，兼氧设为静置反应)、染料浓度(25、50、100、150和200 mg/L)、pH(5、6、7、8、9和10)及温度(20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃)对孔雀石绿脱色率的影响。

1.2.3 脱色率测定与紫外-可见吸收光谱分析

取50 mg/L孔雀石绿溶解液、1 h和6 h的降解上清液(12 000 r/min离心3 min)，用紫外分光光度计在190～800 nm范围内进行全波长扫描。再用紫外分光光度计测得反应液在617 nm波长处吸光度的下降情况[11]。按以下公式计算:

Dr= (C0-Ct) /C0× 100%

其中，C0为原染料浓度，Ct为剩余染料浓度，Dr为脱色率。

1.2.4 降解产物分析

收集50 mg/L孔雀石绿原液、6 h和12 h的混合培养物，并在12 000 r/min下离心10 min，取上清液。用50 mL的三氯甲烷(sigma)萃取3次，合并萃取液，加入无水硫酸钠脱水，旋干，溶解在1 mL的甲醇(sigma)中，用TSQ8000EVO三重四级杆气质联用仪(Thermo Fisher Scientific)进行GC-MS分析。柱温设定为从50 ℃升温至320 ℃(30 ℃/min)，9 min内升至320 ℃。载气(甲烷)流速为1.0 mL/min，分流比10∶1，离子源为EI，离子源温度280 ℃。

2 结果与分析

2.1 高效脱色菌株的筛选及鉴定

从污泥中筛选了对孔雀石绿具有较强脱色能力的高效菌株JY-11和HCS77，其相关序列提交GenBank，登录号分别为MK813903和MK813372。通过Blast软件在GenBank数据库中进行序列比对，经MEGA 5.2软件构建系统发育树(图1)。结果显示菌株JY-11的l6S rDNA序列与Pseudomonasaeruginosastrain PA06 MN326719.1的距离最近，同源性为99%，确定菌株JY-11为铜绿假单胞菌，菌株HCS77的l6S rDNA序列与Bacilluscereusstrain HVR22 JQ739719.1同源性为99%，确定菌株HCS77为蜡质芽孢杆菌。

图1 基于l6S rDNA序列构建的铜绿假单胞菌JY-11 (a)和蜡质芽孢杆菌HCS77(b)的系统发育树Figure 1 Phylogenetic trees of Pseudomonas aeruginosa JY-11 (a) and Bacillus cereus strain HCS77 (b) based on a comparative analysis of 16S rDNA sequence

2.2 混合菌群降解孔雀石绿及动力学分析

在兼氧、pH 7.0、30 ℃条件下，考察2株单菌(铜绿假单胞菌JY-11和蜡样芽胞杆株单菌HCS77)与J-H混合菌群(活菌和死菌)对孔雀石绿(50 mg/L)的脱色效果。图2显示J-H混合菌群较单菌对孔雀石绿具有更高的降解效率，在4 h时对孔雀石绿的脱色率近乎100%，而单菌JY-11和HCS77仅为3.67%和73.09%，且该混合菌群完全脱色时间较单菌快5倍。据报道，利用一株新分离的真菌Lasiodiplodiasp.在最优条件下降解孔雀石绿(50 mg/L)，需反应24 h才能达到96.9%的脱色率[12]。利用BacilluscereusKM201428处理含3.65 mg/L孔雀石绿的废水，需培养12 h才能到达脱色终点[13]。由此可见J-H混合菌群对孔雀石绿的脱色能力明显优于单菌及其他脱色菌株，这表明混合培养的微生物间存在协同代谢作用[14-15]。4 h时混合菌群的死菌吸附对孔雀石绿的脱色率仅为13.9%，此后44 h内维持不变，证实混合菌群对染料脱色主要经微生物降解。

图2 混合菌群(活菌和死菌)与纯菌株的脱色对比Figure 2 Comparison of decolorization between mixed bacteria (living bacteria and dead bacteria) and pure strains

在兼性好氧、pH 7.0、30 ℃和染料浓度为50 mg/L条件下，计算0、0.5、1、1.5、2和4 h时，混合菌群对孔雀石绿的降解速率，对J-H混合菌群降解孔雀石绿的动力学过程进行分析表明，J-H混合菌群对孔雀石绿脱色的动力学与二级动力学拟合度最高(R2=0.925 8)，与一级动力学拟合度较低(R2=0.785 7)。因此，J-H混合菌群对孔雀石绿的脱色过程符合二级动力学过程(图3)，其特征可用二级模型来进行解释。

图3 J-H混合菌群对孔雀石绿脱色的动力学分析Figure 3 Kinetic analysis of malachite green decolorization by J-H mixed flora

2.3 不同因素对混合菌群降解孔雀石绿的影响

在pH 7.0、30 ℃和染料浓度为50 mg/L条件下，研究J-H混合菌群在好氧、兼氧和厌氧条件下对孔雀石绿的脱色能力。结果表明：在好氧、兼氧条件下，J-H混合菌群对孔雀石绿的脱色效果好，兼氧条件下4 h脱色率达99.54%，而厌氧条件下脱色率仅为有氧条件下脱色率的一半[图4(a)]。这是由于铜绿假单胞菌与蜡质芽孢杆菌均为需氧菌，在严格厌氧条件下无法正常生长导致脱色能力不佳。

不同浓度的孔雀石绿对J-H混合菌群降解的影响见图4(b)。结果表明，当孔雀石绿浓度为25 mg/L时，J-H混合菌群2 h内即脱色完成，其脱色时间仅为混合菌群对50 mg/L孔雀石绿完全脱色时间的一半。而当孔雀石绿浓度为100、150和200 mg/L时，12 h脱色率为91.04%、41.83%和34.84%。J-H混合菌群的脱色能力与染料浓度呈反比关系，这一结果与几种微生物如Photobacteriumleiognathistrain MS[16]和Cedeceadavisae[17]对孔雀石绿的脱色结果颇有相似之处。染料浓度愈高，其毒性愈强，从而抑制脱色菌株的生长、产酶或阻塞酶的活性位点，进而影响微生物菌群对染料的脱色[12,18]。

图4(c)显示孔雀石绿浓度为50 mg/L时，不同pH值对J-H混合菌群脱色的影响；pH值为5～8的范围内脱色效果较好，2 h脱色率在90%以上，pH值为6时脱色效果最佳，2 h内完全脱色；pH值为9～10时，12 h内脱色率仍在75%以上。这些结果证实J-H混合菌群具有较强酸碱适应性，能在较宽的pH值在5～10范围内降解孔雀石绿。JY-11和HCS77纯菌株对孔雀石绿的最适脱色pH值范围分别为6～8和5～7。与纯菌株相比，J-H混合菌群对印染废水的pH值耐受性会更大。

混合菌群在20 ℃～40 ℃范围内对50 mg/L孔雀石绿的脱色效率[图4(d)]表明，环境温度为30 ℃时，J-H混合菌群对孔雀石绿的脱色效果最优，2 h脱色率可达99.53%。当温度低于或高于30 ℃时(20 ℃～40 ℃)，脱色率均有降低，但12 h内脱色率仍在95%以上。不同菌种对孔雀石绿的最适脱色温度有差异。JY-11纯菌株对孔雀石绿脱色的最佳温度在30 ℃～40 ℃范围内，HCS77纯菌株对孔雀石绿脱色的最佳温度在20 ℃～35 ℃范围内。

图4 供氧条件(a)、染料浓度(b)、pH(c)和温度(d)对脱色率的影响Figure 4 Effects of oxygen supply (a), dye concentration (b), pH (c) and temperature (d) on decolorization rate

2.4 混合菌群降解孔雀石绿的产物分析及降解机理

已有研究表明，不同种类细菌对孔雀石绿脱色途径相似[1]。脱色前，孔雀石绿全波长扫描光谱在618 nm处有一个特征主峰，在316 nm、422 nm处有两个较小的峰(图5)，其中618 nm处的特征主峰在脱色后逐渐消失，而316 nm、422 nm处的特征吸收峰则显著降低，且脱色后有2个新的吸收峰产生(250 nm和369 nm)。说明染料的共轭结构被完全破坏[20]。有研究证实若为细胞吸附下的脱色，则所有吸收峰均成比例地降低，若为生物降解下的脱色，则吸收峰会逐渐消失并产生新峰，即发色基团被降解并出现新的产物[19-20]。由此表明 J-H混合菌群对孔雀石绿的脱色是生物降解的结果。

图5 降解前后孔雀石绿的全波长扫描图谱Figure 5 UV-visible spectrum of malachite green before and after degradation

如图6和图7所示，孔雀石绿原液于10.39 min时出峰，其分子离子峰对应的质荷比为330。经过12 h脱色，10.39 min时的色谱峰基本消失，同时产生2个新的色谱峰，出峰时间分别为8.90 min(质荷比为225)和12.67 min(质荷比为136)。通过与GS/MS数据库中的标准物进行比对，证实新产生的2种产物分别为4-(二甲氨基)二苯甲酮和4-(二甲氨基)苯酚。这一结果与Micrococcussp. strain BD1[21]、Shewanelladecolorationis. NTOUl[22]和Burkholderiacepacoa[23]降解孔雀石绿的产物基本一致。

图6 降解前(a)和降解后(b)的孔雀石绿GC-MS色谱图Figure 6 Chromatography in GC-MS of malachite green before (a) and after (b) degradation

图7 无色孔雀石绿(a)、孔雀石绿降解产物4-(二甲氨基) 二苯甲酮(b)和4-(二甲氨基)苯酚(c)的质谱图Figure 7 Mass spectrogram of leucomalachite green (a), malachite green degradation product 4-(dimethylamino) benzophenone (b) and 4-(dimethylamino) phenol (c)

根据孔雀石绿降解产物的分析，推测J-H混合菌群对孔雀石绿的降解途径(图8)：孔雀石绿(MG)先经加氢反应转化为无色孔雀石绿(LMG)，然后孔雀石绿中心碳发生羟基化反应，随后该位置迅速发生碳-碳键断裂，产生两种新的产物，即 4-(二甲氨基) 二苯甲酮和4-(二甲氨基)苯酚。

图8 J-H混合菌群降解孔雀石绿的可能降解途径Figure 8 The possible degradation pathway of malachite green by J-H mixed flora

混合菌群对有机污染物的高效降解，主要是通过微生物间互利共生、酶系互补[24]。单一菌株酶种类不全或酶量配比不协调，因此，多菌种混合培养弥补了单一菌株这方面的缺陷，从而提高对有机物的降解能力。

3 讨论

据目前的研究报道，微生物法对有色废水中孔雀石绿的去除颇有成效。Du等[25]发现Pseudomonassp. strain DY1在反应24 h时对100 mg/L孔雀石绿的脱色率可达90.3%。Deng等[26]研究发现将一株新分离的Bacilluscereusstrain DC11用于降解孔雀石绿(20 mg/L)，在4 h时即可达到95%的脱色率。但将共培养微生物应用于孔雀石绿的降解并没有相关的研究报道。

在本研究中利用由铜绿假单胞菌JY-11和蜡样芽胞杆菌HCS77构成的J-H混合菌群在最优条件下对50 mg/L孔雀石绿进行降解，2 h内即实现完全脱色。该混合菌群不仅具强降解能力，对严苛的环境条件也有较好的适应性，在工业废水处理上具有广阔的应用前景。后续将往实验室运行的序批式反应器中外加高效混合菌群，探究其对废水生物处理系统的强化作用，以期实现该高效混合菌群在工业实践上的应用。

4 结论

(1)从污泥中分离筛选出的两株对孔雀石绿具有较强脱色能力的高效菌株分别命名为铜绿假单胞菌JY-11和蜡样芽胞杆菌HCS77，两者按比例混合成为J-H混合菌群。(2)J-H混合菌群对孔雀石绿脱色效果优于单菌，反应4 h脱色率接近100%，符合二级反应动力学过程。(3)不同因素对J-H混合菌群脱色孔雀石绿的影响结果表明，兼氧和好氧条件、低染料浓度均有利于孔雀石绿的脱色；且该混合菌群对pH和温度的适应能力较强。在最优条件下，2 h内J-H混合菌群对孔雀石绿脱色完全。(4)J-H混合菌群降解孔雀石绿的主要产物为4-(二甲氨基)二苯甲酮和4-(二甲氨基)苯酚。