新生期母婴分离对不同年龄段小鼠内脏痛敏及焦虑抑郁行为的影响

陈彬彬 万海方

慢性内脏痛是临床上慢性疼痛中最常见的疾病之一[1]。抑郁症和焦虑症是由多因素引起的常见的神经精神类疾病，其中抑郁症有着显著持久的情绪低落、低自尊、社交退缩等特点；而焦虑症是在面对威胁或压力时所产生的强烈、过度和持续的恐惧感，同时出现焦虑和抑郁症状比单独出现更为常见[2]。大量文献报道，早期生命受到不良刺激的应激，如家庭破裂、毒素暴露、营养不良等，与成年后表现出的内脏痛敏及精神行为改变症状有着紧密关联[3]。而目前对此的治疗效果不甚理想，严重影响了患者生活质量，因此有效分析这种内脏痛敏的变化规律及焦虑抑郁样行为特征，对提高治疗效果显得尤为必要。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选用成年清洁级C57BL/6 小鼠45只，其中15 只雄鼠和30 只雌鼠，购自徐州医科大学实验动物中心[许可证号：SYXK（苏）2015-0030]，适应1 周后给予分笼，每笼放置1 只雄鼠和2 只雌鼠，待雌鼠怀孕后进行单笼饲养，所产仔鼠则为实验所需的新生鼠，待小鼠21 天断奶，并与母鼠分笼饲养；30 天区分雌雄且分笼饲养至成年后，选用雌性小鼠进行实验，实验共选用小鼠180 只，其中母婴分离（MS）和非母婴分离（NMS）小鼠各90 只。实验过程中对动物的处置符合相关动物伦理学处理标准条例。

1.2 实验仪器 小鼠结直肠扩张气囊自制；BL-420E+生物机能实验系统购自成都泰盟；高架十字迷宫和旷场箱均购自上海软隆。

1.3 实验模型及分组 MS 组小鼠从出生后第2 天开始，每天上、下午各与母鼠分离3h（9：00-12：00 和14：00-17：00），分离期间仔鼠被转移到有洁净垫料和加热毯的饲养笼中，持续14 天；NMS 组小鼠不予任何处理。按小鼠不同年龄分为青年组（3 月龄）、中年组（10 月龄）和老年组（18 月龄），分别进行腹外斜肌放电和内脏痛阈水平测定实验，每个实验中各组分别取小鼠16 只，其中NMS 小鼠和MS 小鼠各8只，研究NMS 小鼠和MS 分离小鼠随着年龄增长内脏痛敏的变化规律。将3 月龄成年小鼠束缚于50mL离心管（整个管身烫制多处出气孔）中2h，建立急性束缚应激模型，实验分为NMS+急性束缚应激组（NMS+R）、MS+急性束缚应激组（MS+R），分别进行高架十字迷宫和旷场实验，每个实验中各组分别取小鼠8 只，研究小鼠焦虑样行为变化。取NMS 小鼠和MS 小鼠各10 只，进行糖水偏好实验，研究小鼠抑郁样行为变化。

1.4 腹外斜肌放电实验 首先将小鼠固定在手术台上，七氟烷麻醉后，将自制的且涂抹石蜡油的小鼠结直肠扩张（colorectal distension，CRD）气囊插入肛门内2cm，外导管固定后分别连接注射器和血压计，并将银丝双极电极插入一侧距中线1.5cm 的腹股沟韧带上方的腹外斜肌上，待小鼠完全清醒后分别给予20、40、60、80mmHg（1mmHg=0.133kPa）CRD 压力梯度刺激，每次加压持续10s，间隔至少4min。BL-420E+生物机能实验系统记录不同扩张压力刺激下小鼠腹外斜肌放电波幅变化。

1.5 内脏痛阈水平测定 实验前12h 禁食不禁水，七氟烷麻醉后，按上述方法置入扩张气囊，肛门外导管用胶布固定于小鼠尾根部，再经三通分别与注射器和血压计连接，待小鼠完全清醒后开始实验。通过注射器持续、缓慢加压，当观察到小鼠下腹壁明显抬离箱底或收缩变平时立即停止加压，记录此时血压计上显示的压力值，扩张压力范围在10～80mmHg 之间，重复3 次，取平均值作为小鼠内脏痛阈值。

1.6 高架十字迷宫实验 将小鼠背对实验人员，置于距离地面40cm 的高架十字迷宫中央部，头朝开放臂（长30cm，宽6cm），摄像机记录6min 内小鼠累积进入开放臂次数和开放臂时间的百分比。

1.7 旷场实验 选用不反光的浅色旷场实验箱（50cm×50cm×50cm），将底部分为16 小格，其中中间4 小格定义为中间区域，将小鼠放入实验箱内的中心区域，计算机分析系统记录6min 内小鼠中间区域停留时间和实验箱内总移动距离。

1.8 糖水偏好实验 小鼠单笼饲养，给予1%蔗糖水和自来水各1 瓶，两瓶水置于同一高度，并定期交换位置，适应48h；禁食禁水24h 后，与适应期类似方法，同时给予小鼠事先已称重的1%蔗糖水和自来水各1 瓶，2h 后取走水瓶，并对水瓶再次进行称重，得出每只小鼠糖水偏好百分比＝蔗糖水消耗量/（蔗糖水＋自来水消耗量）×100%。

1.9 统计学方法 应用SPSS 20.0 软件进行统计分析，计量资料用均数±标准差（）表示，数据均进行方差齐性检验，两组比较采用t 检验；多组比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），Bonferroni 方法进行两两比较；各组间比较采用双因素重复测量方差分析（two-way repeated measures ANOVA），P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 新生期母婴分离引起不同年龄段小鼠内脏痛敏的差异

2.1.1 不同CRD 压力刺激下各年龄段小鼠腹外斜肌放电波幅变化 与NMS 相比，MS 青年组分别在20、40、60mmHg 及中年组20、40mmHg CRD 压力刺激下，腹外斜肌放电波幅显著增加（P＜0.05 或P＜0.01），而老年组20、40、60 及80mmHg CRD 压力刺激下CRD 压力刺激下MS 小鼠腹外斜肌放电波幅均无显著改变（P＞0.05）。见表1-4。

表1 20mmHg CRD 压力刺激下各年龄段小鼠腹外斜肌放电波幅比较（μv，）

表1 20mmHg CRD 压力刺激下各年龄段小鼠腹外斜肌放电波幅比较（μv，）

注：青年组、中年组和老年组分别表示3、10 和18 月龄小鼠；CRD 为结直肠扩张；NMS 为非母婴分离；MS 为母婴分离；1mmHg=0.133kPa；与NMS 比较，aP＜0.05，aaP＜0.01

表2 40mmHg CRD 压力刺激下各年龄段小鼠腹外斜肌放电波幅比较（μv，）

表2 40mmHg CRD 压力刺激下各年龄段小鼠腹外斜肌放电波幅比较（μv，）

注：青年组、中年组和老年组分别表示3、10 和18 月龄小鼠；CRD 为结直肠扩张；NMS 为非母婴分离；MS 为母婴分离小鼠；1mmHg=0.133kPa；与NMS 比较，aP＜0.05，aaP＜0.01

表3 60mmHg CRD 压力刺激下各年龄段小鼠腹外斜肌放电波幅比较（μv，）

表3 60mmHg CRD 压力刺激下各年龄段小鼠腹外斜肌放电波幅比较（μv，）

注：青年组、中年组和老年组分别表示3、10 和18 月龄小鼠；CRD 为结直肠扩张；NMS 为非母婴分离；MS 为母婴分离；1mmHg=0.133kPa；与NMS 比较，aaP＜0.01

表4 80mmHg CRD 压力刺激下各年龄段小鼠腹外斜肌放电波幅比较（μv，）

表4 80mmHg CRD 压力刺激下各年龄段小鼠腹外斜肌放电波幅比较（μv，）

注：青年组、中年组和老年组分别表示3、10 和18 月龄小鼠；CRD 为结直肠扩张；NMS 为非母婴分离；MS 为母婴分离；1mmHg=0.133kPa

2.1.2 不同年龄段小鼠内脏痛阈水平变化 与NMS相比，青年组与中年组MS 小鼠内脏痛阈显著降低（P＜0.05），而老年组无明显差异（P＞0.05）。见表5。

表5 不同年龄段小鼠内脏痛阈水平比较（mmHg，）

表5 不同年龄段小鼠内脏痛阈水平比较（mmHg，）

注：青年组、中年组和老年组分别表示3、10 和18 月龄小鼠；NMS 为非母婴分离；MS 为母婴分离；1mmHg=0.133kPa；与NMS 比较，aP＜0.05

2.2 新生期母婴分离引起成年小鼠焦虑抑郁样行为表现

2.2.1 新生期母婴分离引起小鼠成年后焦虑样行为表现 在高架十字迷宫实验中，与NMS 组比较，MS组小鼠开臂次数和开臂时间的百分比均显著减少（P＜0.01）；NMS 和MS 组小鼠分别给予急性束缚应激后，与NMS 组小鼠比较，NMS+R 组小鼠开臂次数和开臂时间百分比减少（P＜0.05）；与NMS+R 组比较，MS+R 小鼠开臂次数和开臂时间百分比均进一步显著减少（P＜0.05 或P＜0.01)。在旷场实验中，与NMS组相比较，MS 组小鼠中心区域停留时间和旷场中移动总距离均显著减少（P＜0.01)；NMS+R 组小鼠旷场中移动总距离显著减少（P＜0.05）；与NMS+R 组比较，MS+R 组小鼠中心区域停留时间和旷场移动总距离显著减少（P＜0.05 或P＜0.01），表现出显著的焦虑样行为。见表6。

表6 四组小鼠在高架十字迷宫和旷场实验中行为学比较（）

表6 四组小鼠在高架十字迷宫和旷场实验中行为学比较（）

注：NMS 为非母婴分离小鼠，NMS+R 为非母婴分离小鼠给予急性束缚应激；MS 为母婴分离小鼠；MS+R 为母婴分离小鼠给予急性束缚应激；与NMS 组比较，aP＜0.05，aaP＜0.01；与NMS+R 组比较，bP＜0.05，bbP＜0.01

2.2.2 新生期母婴分离引起成年小鼠抑郁样行为表现 与NMS 比较，MS 组小鼠的糖水消耗百分比显著降低（P＜0.05），表现出明显快感缺失的抑郁样行为。见表7。

表7 两组小鼠糖水消耗百分比比较（%，）

表7 两组小鼠糖水消耗百分比比较（%，）

注：NMS 为非母婴分离小鼠；MS 为母婴分离小鼠；与NMS 组比较，aP＜0.05

3 讨论

新生期是大脑快速生长，神经元发育的关键时期，在此期间遭受不良刺激，脑内相关神经元的可塑性、突触功能、胶质细胞活化及分泌的炎症因子水平可发生改变[4]，常常引起成年后多种行为表型的异常，其中慢性内脏痛觉高敏和精神行为改变是目前研究的热点[5-6]。

母婴分离是目前广泛使用的早期生命应激模型之一。本实验首先通过建立母婴分离模型来模拟人类早期经历的生活逆境，并采用腹外斜肌放电和痛阈检测实验手段得出小鼠成年后不同年龄段内脏痛觉高敏的变化规律；进一步采用旷场实验、高架十字迷宫实验和糖水偏好实验评价小鼠成年后焦虑抑郁样行为特征内容，多方式验证早期生命应激对小鼠成年后诱发的内脏痛敏症状和精神改变产生的影响。

有研究指出，母婴分离致小鼠成年后肠道敏感性增加和焦虑抑郁样表现中，雌性小鼠较为易感[7]，这也与临床中女性患者内脏痛敏和焦虑抑郁症的发病率较高相吻合，因此本次研究用雌性小鼠进行实验[8-9]。本次实验通过生命早期给予母婴分离不良刺激，导致小鼠成年后发生内脏痛觉高敏现象，这与以往的研究结果相一致[10]；而随着小鼠年龄增加，这种内脏痛敏症状可得到自然缓解，直至老年后基本消失。在高架十字迷宫实验中可知生命早期经历母婴分离至成年后小鼠开臂的次数和时间均减少，产生焦虑样行为，此时再次给予急性束缚应激来模拟成年后人类受到来自生理或心理的压力，表现出更为严重的焦虑样行为；旷场实验作为研究动物自主运动能力、新异环境探索欲望、焦虑及抑郁等情绪障碍经典实验，MS 组小鼠在移动总距离和中央格停留时间均减少，再次受到束缚应激后也表现出更为严重的情绪障碍[11]。糖水偏好实验中显示，新生期母婴分离小鼠成年后有明显的快感缺失，表现出显著的抑郁样行为改变，这与Gill 等[12]的研究结果相一致。这提示生命早期经历不良刺激，成年后可诱发严重的焦虑抑郁样行为，且抗压应激能力也得到很大程度的削弱。

自然环境下母鼠对幼鼠舔舐、梳理皮毛等的精心照料，使其肾上腺皮质功能处于低反应状态，下丘脑-垂体-肾上腺皮质（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）轴对外界刺激所产生的应激反应功能降低，这给幼鼠中枢神经系统生长发育及成熟提供良好的条件，形成天然的抗压抗应激能力[13]。而在母婴分离过程中，HPA 轴处于高反应状态，且这一效应可持续至成年，有研究表明HPA 轴异常活化参与促进了新生期结直肠扩张应激致慢性内脏痛过程[14]；同时这对幼鼠神经元发育也产生不同程度的损害，诱发幼鼠成年后焦虑抑郁样表现[15]。

综上所述，新生期母婴分离是一个有效诱发小鼠成年后内脏痛敏和焦虑抑郁样行为的模型，所诱发的内脏痛敏症状可随着年龄增加而逐渐缓解，且对急性束缚应激的焦虑调节能力明显降低，这将为深入研究生命早期应激引起的内脏痛敏症状和焦虑抑郁样行为的基础研究提供实验依据。