电针对高脂肥胖大鼠脂质蓄积及瘦素抵抗的影响

龚美蓉， 李 茜， 张无双， 陈 璐， 戴欣露，达明志， 汤栋梁， 毕肖林*

(1.南京中医药大学 针药结合教育部重点实验室，江苏 南京 210023；2.南京中医药大学 药学院，江苏 南京 210023)

肥胖症是由特定生化因子引起的一系列进食与能量调控的紊乱，过多摄入的能量以甘油三酯的形式过量蓄积以至于患者体重异常增加从而引起的一种代谢性疾病。近年来肥胖发病率逐年增加，因其伴随诸多并发症，如2型糖尿病、高血脂、心脑血管疾病等而备受关注。临床和实验研究发现瘦素抵抗是食源性肥胖症的显著特征，故提高机体对瘦素的敏感性是解决肥胖症的一个关键步骤。在肥胖症众多治疗方法中，针刺治疗因其简、便、效、廉而备受人们关注。针刺可以疏通经络，平衡阴阳，降低患者的食欲，同时增加其能量的消耗。本研究拟通过观察电针对肥胖大鼠脂质蓄积与瘦素抵抗的影响，为临床上治疗与预防肥胖症的提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 动物

健康SD大鼠42只，雄性，3周龄，体重70～90 g，由上海斯莱克实验动物由限责任公司提供，动物合格证号：SCXK(沪)2012-0002。所有动物均饲养于南京中医药大学动物实验中心动物房内，温度20～22 ℃，期间可以自由饮水和进食。该批动物实验由南京中医药大学伦理委员会批准(201809A015)。

1.2 仪器与试剂

荧光定量PCR仪(Stratagene公司)，核酸蛋白测定仪(Eppendorf公司)，高速低温离心机(Eppendorf公司)，PCR仪(Bio-RAD公司)。瘦素ELISA试剂盒(R&D公司)，Trizol试剂(Takara公司)，荧光PCR试剂盒(Takara公司)，转录试剂盒(Takara公司)。

1.3 肥胖大鼠模型的建立

将42 只3周龄SD雄性大鼠，在动物房适应性饲养1周后，肥胖造模方法参考孙志等提出的高脂饲养，随机挑选6只给予普通饲料，简称正常组；另一组36只给予高脂饲料，简称高脂组。造模期间每周测量体重用以观察大鼠的造模情况。12周后，筛选出体重大于正常组15%的SD定义为肥胖鼠，成功造模18只肥胖SD鼠。将此18只肥胖鼠平均分为3组(n=6/组)：模型组、电针组、假针刺组。

1.4 电针治疗

电针组：操作时，将大鼠固定在自制的固定器上，常规酒精消毒后，无菌针刺大鼠一侧“足三里”和“内庭”穴，接通电针仪，电流为2 mA，频率2/15 Hz，留针时间每次15 min，每日治疗1次，左右侧轮流转换取穴针刺，连续针刺6 d/周，休息1 d/周，治疗时间为28 d。假针刺组：将针灸针贴于大鼠相应穴位的皮肤上，然后连接电针仪，参数同电针组。正常组与模型组用同样的方式固定15 min，不进行针刺治疗。

1.5 标本采集

针刺治疗28天后，禁食12 h，眼球取血，分离血清待测，常温低速离心20 min。处死动物，剥离项后脂肪、附睾脂肪、肾周脂肪质量并测量湿重。断头开颅，迅速分离下丘脑。所取组织经过液氮迅速冷冻后，立即转移至-80 ℃保存。取出肝脏组织，称重，切合适大小浸泡于10%的甲醛溶液中。

1.6 血清指标测定

大鼠血清总胆固醇(TCL)与甘油三酯(TG)的含量用全自动生化仪进行检测(南京市中医院)，大鼠血清中瘦素水平采用ELISA方法检测，严格按照大鼠瘦素ELISA试剂盒上的步骤操作。

1.7 实时定量PCR检测

GeneBank上查找OBRb mRNA序列，并设计特异性引物，β-actin：上游为CACTATCGGCAATGAGCG，下游为AGGAGCCAGGGCAGTAATC；OBRb:上游为TCCAGGTGAGGAGCAAGAG，下游为TTCAGCGTAGCGGTGATG，上海生工公司合成。100 mg下丘脑总RNA提取按照Trizol试剂盒说明书进行。A/A≈2.0，并测定RNA浓度。根据逆转录试剂盒，总RNA取0.5 μg，42 ℃15 min，85 ℃15 s，合成cDNA。根据荧光定量PCR试剂盒，反应体系：总体系为20 μL，进行1个循环(95 ℃ 30 s)，继而进行40个循环(95 ℃ 5 s→60 ℃ 30 s)。荧光定量PCR反应结束后，计算基因表达的相对变化，以β-actin为内参进行标准化，2分析。

1.8 HE染色

将浸泡固定于10%甲醛溶液中的肝脏组织取出来，进行石蜡包埋，切片，HE染色，封片，光学显微镜下观察(40×)，并拍照记录肝脏细胞形态。

1.9 统计学方法

2 结果与分析

2.1 电针治疗前后体质量的变化

治疗前，与正常组相比，模型组、电针组与假针刺组大鼠的体重均明显升高(

P

<0.01)，提示肥胖大鼠造模成功。电针治疗28 d后，电针组大鼠的体重明显低于较模型组(

P

<0.05)。假针刺组较模型组大鼠体重无明显差异(

P

>0.05)(表1)。

表1 各组大鼠体质量的变化(n=6)

2.2 电针对肥胖大鼠不同部位脂肪量的影响

与正常组相比，模型组大鼠内脏脂肪质量(附睾脂肪与肾周脂肪量之和)、项后脂肪量、脂体比与项后脂体均显著升高(

P

<0.05)。电针治疗28 d后，电针组大鼠内脏脂肪质量、项后脂肪量、脂体比与项后脂体显著低于模型组(

P

<0.05)。假针刺组大鼠内脏脂肪质量与脂体比较模型组无明显差异(

P

>0.05)。假针刺组项后脂肪量与项后脂体明显低于模型组(

P

<0.05)(表2)。

表2 各组大鼠不同部位脂肪量的比较(n=6)

2.3 电针对肥胖大鼠TCL、TG、Leptin的影响

与正常组比较，模型组大鼠TCL、TG、Leptin含量显著上升(

P

<0.05)。电针治疗后，电针组大鼠TCL、TG、Leptin水平明显明显低于模型组(

P

<0.05)。假针刺组大鼠TCL、TG、Leptin水平与模型组无明显差异(

P

>0.05)(表3)。

表3 各组大鼠的血清生化指标的比较(n=6)

2.4 电针对肥胖大鼠下丘脑瘦素受体水平的影响

与正常组比较，模型组瘦素受体mRNA表达量显著下降(

P

<0.01)。电针治疗后，电针组瘦素受体mRNA表达量明显高于模型组(

P

<0.05)。假针刺组大鼠瘦素受体mRNA表达量与模型组无明显差异(

P

>0.05)(表4)。

表4 各组大鼠下丘脑瘦素受体mRNA表达量的比较(n=3)

2.5 电针对肥胖大鼠肝脏细胞形态学影响

正常组大鼠的肝脏细胞整齐排列。观察模型组大鼠肝脏细胞，发现有较多的脂滴的空泡，显明其细胞中存在较重的脂肪浸润。电针治疗后，电针组大鼠肝脏细胞较模型组大鼠脂滴空泡明显减少，其形态与正常组接近。假电针组大鼠脂滴空泡较模型组大鼠略有减少，但与电针组大鼠明显增加(图1)。

图1 各组大鼠肝脏细胞形态观察(HE染色，40×)

3 结论与讨论

相比手术减肥和药物减肥，临床上针刺作为中医诊疗的一种常规疗法被应用于肥胖的治疗，因其疗效显著、不易反弹、简便经济、安全无毒副作用被广大患者所接受。本研究通过高脂饮食喂养建立肥胖大鼠模型，治疗采用足三里与内廷为有效配伍穴位，此二穴都属足阳明胃经，二穴合用可增加传导运化的作用。结果表明电针干预后肥胖大鼠的体质量明显降低，实现较好的减肥效应。

肥胖是体内脂肪过量堆积的状态，脂肪分布特征与肥胖症及其并发症的发生关系密切，有研究表明控制肥胖的危害关键在于使其脂肪分布更加良性。腹型肥胖由于其内脏脂肪堆积过量，二型糖尿病与冠心病发病率随之增加，所以观察脂质蓄积的状况是治疗肥胖的重要指标。本研究观察电针对肥胖大鼠内脏脂肪量、血脂中TG和TCL含量、肝脏中脂滴的影响。结果表明电针治疗后肥胖大鼠内脏脂肪量显著下降，同时改善紊乱的血浆脂代谢，肝脏中异位存储的脂滴明显较少。电针治疗之后脂质的蓄积量明显较少。瘦素含量反映机体内脂肪储存的状况，也是衡量肥胖程度以及评价减肥疗效的一项重要指标。瘦素主要作用于中枢神经系统，减少能量摄入，增加能量的消耗，从而使得机体内的脂质量保持相对的稳定。瘦素的效应由其瘦素受体OB-R介导，其中OB-Rb在下丘脑的弓状核广泛分布，瘦素与其结合后改变下丘脑神经元产生特定的神经肽，从而调节机体能量的平衡。本研究表明较正常大鼠，肥胖大鼠血清中瘦素含量明显上升，下丘脑中瘦素受体mRNA表达量明显下降，机体中表现出瘦素抵抗，使瘦素不能发挥正常的生物学效应导致脂质堆积而肥胖。电针干预治疗后肥胖大鼠瘦素抵抗的状况得到明显改善，使得瘦素降脂作用得到正常发挥，继而肥胖大鼠的内脏脂肪、血脂、肝脏异位脂肪堆积减少，改善其肥胖程度。

综上所述，本研究观察了电针治疗对肥胖大鼠体重、体脂、血脂、肝脏异位脂肪堆积的影响，同时观察了电针对血清中瘦素含量与下丘脑瘦素受体mRNA水平表达的影响。推测电针治疗肥胖的机理可能与改善瘦素抵抗有关，进而减少脂质在机体中的蓄积，为针刺减肥的临床推广应用提供理论依据。