酵母菌发酵制备葛根酵素的工艺研究

朱德艳

摘 要：以葛根为原料，酵母菌为发酵菌种，在考察发酵时间、发酵温度、发酵初始pH和接种量的基础上，采用正交试验优化最佳工艺。结果表明，最佳工艺条件为：发酵时间72h、发酵温度29℃、发酵初始pH5.5、酵母菌接种量3%。在此条件下，α-淀粉酶活力为33.56U/mL。

关键词：酵母菌;葛根酵素;工艺

中图分类号 TS201.1文献标识码 A文章编号 1007-7731（2021）13-0149-04

1 引言

葛根为豆科植物的干燥根，是我国传统的常用中药材之一，药食两用，其化学成分主要有黄酮类、三萜皂苷类、葛酚苷类、香豆素类、有机酸等[1]。葛根味干、辛，性凉，归肺、胃经，始载于《神农本草经》，具有解肌退热、生津止渴、升阳止泻之功效，是临床应用较为广泛的一种中药材[2]。葛根中富含黄酮类化合物，是一种天然的水溶性色素，具有降血脂、增强免疫力等多种功效。现代科学研究发现，葛根具有抗心律失常、降血压作用、抗肿瘤作用、降糖降脂、解酒护肝、抗肿瘤、增强免疫、改善骨质疏松等作用[3-5]。葛根中含有大量膳食纤维，可调理肠胃，有助于排出体内毒素;长期食用还可以使皮肤光滑，起到美容养颜的效果。近年来，随着人们生活水平质量的提高，越来越多的人们在生活中都很注重营养与保健，进而对于食品的营养价值的要求越来越高。于是，葛根逐渐出现在大众的视野中，因其具有多种功效及营养价值，使其适合于各类人群食用。如今，各种葛根类在市场的产品层出不穷，葛根粉、葛根混合饮料以及葛根系加工产品。

酵素是采用一种或多种原料，经有益菌发酵的含有多种酶和次级代谢产物等成分的发酵产品[6]。酵素是一类特殊的具有催化功能的复杂蛋白质，部分由人体自身生成，部分由饮食补充。酵素具有促进新陈代谢、促进血液循环、保护肠道、调节人体酸碱平衡、抗氧化、抗疲劳等功能[7-9]。近年来，随着人们生活水平的不断提高，越来越多的人都很注重提高自身的健康水平，而“体内酵素的性能和数量”是衡量健康的一项重要指标。现今，酵素发展迅速，但我国大陆地区有关酵素的研究尚处于起步阶段，与发达国家和地区相比，仍有较大差距，国外的食用酵素产品种类多且在国内的售价普遍昂贵。尽管如此，酵素类产品依然很受欢迎，将可药用和食用的葛根制备的葛根酵素，结合葛根的药性和酵素的特性，具有良好营养价值和功效。因此，葛根酵素的发展前景可观，市场应用前景广阔。

本试验利用葛根为主要原料，以酵母菌为菌种进行发酵，以发酵过程中α-淀粉酶活力为指标，发酵时间、发酵温度，发酵液pH值，菌种的接种量为条件，测定发酵最适条件，以优化葛根酵素的制备工艺。

2 材料与方法

2.1 材料、试剂与仪器

2.1.1 材料与试剂 葛根：湖北省仙之灵有限公司;酵母菌：安琪酵母股份有限公司;α-淀粉酶：天津市福晨化学试剂厂;白砂糖：武汉绿福食品有限公司;白砂糖：武汉绿福食品有限公司;麦芽糖（分析纯）：天津市福晨化学试剂厂柠檬酸（分析纯）：天津市福晨化学试剂厂;磷酸氢二钠（分析纯）：天津市福晨化学试剂厂可溶性淀粉（分析纯）：天津市福晨化学试剂厂;酒石酸钾钠（分析纯）：天津市福晨化学试剂厂;氢氧化钠（分析纯）：天津市福晨化学试剂厂;3，5-二硝基水杨酸（化学纯）：上海展云化工有限公司。

2.1.2 试剂配制 （1）标准麦芽糖溶液：精确称取麦芽糖0.1g，用蒸馏水溶解定容至100mL。（2）0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液：称取柠檬酸5.78g，柠檬酸钠21.32g，加蒸馏水定容至1000mL（取磷酸氢二钾/钠45.3g、柠檬酸7.74g）。（3）淀粉溶液1%：由1g淀粉溶液溶于缓冲液中定容至100mL。（4）3，5-二硝基水杨酸溶液：精确称取3，5-二硝基水杨酸1g，溶于20mL NaOH（2mol/L）溶液中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100mL。盖紧瓶塞，防止CO2进入。

2.1.3 试验仪器 恒温摇床PH20，上海一恒科学仪器有限公司;电热恒温培养箱DH-600，北京科伟永兴仪器有限公司;高压蒸汽灭菌锅YC10-18L，北京中西远大科技有限公司;恒温水浴锅DK-98-1，亚荣生化仪器厂;电子天平JY1002，上海上天精密有限公司。

2.2 试验方法

2.2.1 工艺流程 工艺流程如下：

葛根→清洗→粉碎→干燥→糖化→酶解→调糖→灭菌→接种→发酵→葛根酵素

↓

（酵母菌）

（1）葛根處理：将葛根进行清洗、去虫眼以及去皮处理，切丁，于50℃干燥箱中进行干燥，干燥完成后进行粉碎过筛，将粉碎后的葛根粉与蒸馏水按比例1∶10（g/mL）混合，煮沸糖化1h。

（2）酶解、调糖：向糖化好的葛根试液中加入α-淀粉酶酶解，添加量为14U/g，在50℃的水浴中进行酶解2h。酶解完成后按照1∶10的比例加入白砂糖调节葛根溶液的糖度。

（3）菌种活化：将活性干酵母菌按比例1∶10于蒸馏水中经行溶解，放入到30～35℃糖水中，恒温水浴，放置30min后备用。

（4）灭菌：采用高压蒸汽灭菌法对葛根试液进行灭菌，121℃灭菌15min后冷却至室温备用。

（5）接种：将已经处理好的葛根试液按照试验中的要求接种酵母菌。

（6）发酵：将接种后的葛根试液在试验要求的时间和温度等条件下进行静置发酵，发酵结束后测定α-淀粉酶活力。

2.2.2 α-淀粉酶酶活力测定

2.2.2.1 标准曲线的绘制 取6支试管，按表1进行操作，以1号试管作为空白，沸水浴5min后，用蒸馏水冷却定容至25mL，在540nm的波长下测定吸光度值。以麦芽糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

2.2.2.2 发酵液中α-淀粉酶活力的测定 取1mL的发酵液于试管中，放入40℃水浴保温5min，再加入1mL淀粉溶液（预先40℃保温5min）然后再40℃水浴保温10min，之后加入2mLDNS进行沸水浴5min，最后用蒸馏水定容至25mL于540nm测吸光度。

以1mL的发酵液中的淀粉酶，在40℃时，1min生成1mg的还原糖为1个酶活力单位（U）。

计算公式：

[α-淀粉酶活力（U/mL）=C×N10]

式中：N—酶液稀释倍数;

10—反应时间;

C—麦芽糖浓度

2.2.3 葛根酵素发酵单因素试验

2.2.3.1 发酵时间 向灭菌冷却后的葛根试液中接入3%的酵母菌，29℃条件下进行发酵，发酵时间为24h、48h、72h、96h、120h，144h，测定α-淀粉酶活力，确定酵母菌发酵葛根酵素的最佳发酵时间。

2.2.3.2 发酵温度 在灭菌冷却后的葛根试液中接入3%的酵母菌，发酵温度确定为25℃、27℃、29℃、31℃、33℃，发酵72h，测定α-淀粉酶活力，确定最佳的发酵温度。

2.2.3.3 发酵液初始pH 对已经灭菌冷却好的葛根试液分别调节pH在4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，分别接入3%的酵母菌，在29℃条件下，发酵72h，测定α-淀粉酶活力，确定发酵的最适pH。

2.2.3.4 菌种接种量 向灭菌冷却后的葛根试液中分别接入接种量为2%、3%、4%、5%、6%的酵母菌，调节pH5.0后，在29℃条件下发酵72h，测定α-淀粉酶活力，确定最佳的接种量。

2.2.4 葛根酵素发酵正交试验 在酵母菌发酵葛根酵素单因素试验的基础上，以发酵时间、发酵温度、发酵液的pH值和接种量4个因数为考察对象，以α-淀粉酶活力为指标，确定酵母菌发酵葛根酵素的最佳工艺条件（见表2）。

3 结果与分析

3.1 标准曲线 以麦芽糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。如图1所示，麦芽糖含量与吸光度成正比关系，回归方程为：y=0.1438x+0.0034（R2=0.9721）。

3.2 不同发酵条件对α-淀粉酶活力的影响

3.2.1 发酵时间 向灭菌冷却后的葛根试液中接入3%的酵母菌，29℃条件下进行发酵，发酵时间设为24h、48h、72h、96h、120h，144h，测定α-淀粉酶活力，结果见表3。

从图2可以看出：当发酵时间为24h时，葛根酵素中α-淀粉酶活力较低;当发酵时间为72h时，葛根酵素中α-淀粉酶活力达到19.50U/mL;当发酵时间更长时，葛根酵素中α-淀粉酶活力有所下降。分析其原因短时间的发酵处理还没有起到促进菌种细胞生长，适当的发酵时间有益于酵母菌菌种的生长繁殖，对葛根酵素发酵过程更有益处，但随着发酵处理时间延长，营养物质被消耗，作用就有所下降。因此，最适发酵时间为72h。

3.2.2 发酵溫度 发酵温度分别设为为25℃、27℃、29℃、31℃、33℃，发酵72h后测定α-淀粉酶活力，结果见表4和图3。

从表4和图3可以看出：当发酵温度为25℃时，葛根酵素中α-淀粉酶活力较低，当温度上升到29℃时，酶活力达到22（U/mL）;随着温度的升高，葛根酵素中α-淀粉酶活力有所下降。分析其原因：当温度处于较低水平时，酵母菌活力还不是很旺盛;当温度适当上升时，其产物合成能力提高;温度过高，对酵母菌活力起到抑制作用，其工作能力下降。因此，最适发酵温度为29℃。

3.2.3 发酵初始pH值 发酵液初始pH值分别设为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，接入3%的酵母菌，在29℃条件下，发酵72h，测定α-淀粉酶活力，结果见表5和图4。

从图4可以看出：当初始pH值为4.5时，葛根酵素中α-淀粉酶活力较低，当pH值上升到5.5时，葛根酵素中α-淀粉酶活力达到19.50（U/mL）;随着pH值不断上升，葛根酵素中α-淀粉酶活力有所下降。分析其原因：当pH较低时，酵母菌的活性不是非常旺盛，适当提高pH值有助于酵母菌的发酵，而过多增加pH将会对酵母菌合成产物造成抑制。因此，最适发酵pH值为5.5。

3.2.4 接种量 向发酵液中分别接入2%、3%、4%、5%、6%的酵母菌，调节pH5.0后，在29℃条件下发酵72h，测定α-淀粉酶活力，结果见表6和图5。

从表6和图5可以看出：当接种量为2%时，葛根酵素中α-淀粉酶活力较低，当接种量增加至5%时，葛根酵素中α-淀粉酶活力达到23.25（U/mL）;随着接种量的逐渐增加，葛根酵素中α-淀粉酶活力有所下降。分析其原因：接种量较少时，菌种数量少，利用葛根生产酵素的效率较弱，而当接种量适当提高，加大了酵母菌合成的效率，但由于葛根原料是固定的，继续提高接种量，导致酵母菌无法得到充足的营养，合成产物的能力下降。因此，最适接种量为5%。

3.3 葛根酵素发酵的工艺优化 正交试验结果见表7。从表7可以看出，酵母菌发酵制备葛根酵素的最佳组合为A2B2C3D1，即发酵时间72h、发酵温度29℃、发酵初始pH5.5、酵母菌接种量3%，4个因素影响大小为A>C>B>D，即：发酵时间>发酵初始pH值>发酵温度>酵母菌接种量。在最佳条件下，α-淀粉酶活力大小为33.56U/mL，高于正交试验中的其他组合。

4 结论

以葛根为原材料制备葛根酵素，在单因素和正交试验的基础上确定了酵母菌发酵葛根制备酵素产α-淀粉酶活力的最佳条件组合，即发酵时间72h、发酵温度29℃、发酵初始pH5.5、酵母菌接种量3%。在此条件下，α-淀粉酶活力为33.56U/mL。

参考文献

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（责编：张宏民）