‘冬美人’愈伤组织诱导研究

尹立辉 宛倩 刘欢欢 高慧喆 苑轩楠 刘畅

摘 要：以‘冬美人（Pachyveria pachyphytoides Walth）的外植體进行愈伤组织诱导，从不同外植体、消毒方式、激素浓度、光源等方面研究了‘冬美人外植体在诱导愈伤组织过程中适宜的培养条件与环境因素。结果表明，‘冬美人愈伤组织诱导最适宜的外植体为叶片;在消毒方式上，采用75%酒精中浸泡5s，0.1%HgCl2溶液浸泡10s，1.5%抗坏血酸溶液浸泡10s，可以大幅度减轻外植体褐化的程度，并且污染率也较低;不同类型光源，以日光灯培养效果最好，褐化程度也相对较轻;在激素配比上，最佳愈伤组织诱导培养基为MS+6-BA1.5mg/L+NAA1.0mg/L，诱导率为64%;在培养基中加入一定量的活性炭，可以少量减轻外植体的褐化程度。

关键词：‘冬美人;愈伤组织;诱导率

中图分类号 S567.239文献标识码 A文章编号 1007-7731（2021）13-0028-03

Abstract： Callus induction of Pachyveria pachyphytoldes Walth explants was studied. This experiment mainly from different explants， concentration of hormone， light intensity， concentration of additives， to study the winter beauty stem segments or blade in the induction of callus of the optimum culture conditions and environmental factors in the process. Through research and found that， on the choice of explant and winter beauty of tissue culture in callus induction suitable explant is young， but in training time stem section earlier callus induced; In terms of disinfection method，5s soaked with 75% alcohol，10s soaked with 1.5% ascorbic acid and 10s soaked with 0.1% HgCl2 can greatly reduce the degree of Browning light winter beauty， and the pollution rate is also low. Under the light intensity， under the light intensity around 1500lx， with the increase of time， the culture effect is the best and the Browning degree is relatively light. In the hormone mix， the optimal induction hormone is MS+ 6-BA 1.5 mg/L+NAA 1. 0 mg/L， the induction rate is 64%， in this case， the explants of winter beauty have less Browning degree and less pollution. The addition of activated carbon can effectively inhibit Browning， and the growth of its explants is good. In the culture medium without activated carbon， the explant obviously browned and died.

Key words： Pachyveria pachyphytoldes; Walth Callus; Induction rate

‘冬美人（Pachyveria pachyphytoides Walth），也被称作东美人，为景天科、厚叶草属和石莲花属杂交培育的园艺品种，喜温暖、干燥和光照充足的环境，耐旱性强，叶形较美，株型美观，应用方便。由于多肉植物的市场需求量大，高效大量的繁殖是解决上述问题的重要途径。通过组培快繁体系的建立[1-4]，能有效解决繁殖系数较低、增殖速度较慢的问题。

1 材料与方法

选取‘冬美人新鲜、无病虫害叶片和茎段，在整株植物的中上部剪取。以MS含蔗糖和琼脂的培养基为基础培养基，在此基础上根据设计的培养基配方，分别添加不同含量的植物生长调节剂和活性炭（见表1）。将配置好的培养基分装到培养瓶，每瓶约30mL，做好标记，于121℃下高温灭菌20min，冷却待用。培养温度均为（25±1）℃，培养的光照强度为2000～4000Lx（光源为日光灯、LED红蓝灯），光照时数12h·d-1（每日6：00—18：00），空气相对湿度40%～60%。培养基中均添加琼脂13g·L-1，蔗糖30g·L-1，pH值为5.6～5.8。

采用‘冬美人叶片或茎段为外植体时，先用流水冲去表面的浮土，然后浸泡于加有适量清洁剂的水中3～5min并不断搅拌，再用流水冲洗5～10min，用吸水纸吸取表面所带的水分。放在底部有孔洞的小瓶中，在流水下冲洗30min，然后置于超净工作台上待用。

在超净工作台上先用75%的酒精浸泡，去离子水冲洗3遍，然后用0.1%HgCl2溶液浸泡，为了提高外植体活性，加入1～2滴吐温80，去离子水冲洗3遍，因为存在褐化现象，随后在1.5%抗坏血酸溶液中浸泡，去离子水冲洗3遍。外植体浸泡时间详见表2。

将消毒后的‘冬美人叶片切成1cm2大小，茎段切成0.5cm长，接种于预先配制好的培养基上。每个处理接种30瓶，每瓶接种2～3块，培养时间为30d，调查项目包括污染率、死亡率、褐化率、诱导率等。相关计算公式如下：

污染率（%）=污染个数/接种个数×100;

死亡率（%）=死亡个数/接种后未污染个数×100;

褐化率（%）=褐化个数/接种后未污染个数×100;

愈伤组织诱导率（%）=愈伤组织萌动个数/接种后未污染个数×100

2 结果与分析

2.1 不同外植体对愈伤组织形成的影响 以‘冬美人叶片和茎段为外植体，经过消毒处理，在MS加不同比例激素的培养基中培养。由表3可知，以茎段为外植体诱导愈伤组织污染率高于叶片，且外植体褐化现象更严重，而且在剪取材料时，叶片比茎段更易获得。因此，在‘冬美人组织培养中愈伤组织诱导适宜的外植體是叶片。

2.2 不同消毒处理对愈伤组织形成的影响 由表4可知，不同的消毒方式及消毒时间对‘冬美人外植体污染率、死亡率及生长状况有着明显的差异。由于外植体较幼嫩，消毒时间过长会增加死亡率，特别是在75%酒精中的浸泡时间超过10s，则外植体死亡率超过80%，因此要严格控制浸泡时间，尽量控制在5s以内。在接种后的观察中发现，外植体褐化现象严重，因此在消毒过程中又采用1.5%的抗坏血酸溶液浸泡，对褐化现象有一定的抑制效果。综上，应采取处理Ⅴ的消毒方式，即75%酒精中浸泡5s，0.1%HgCl2溶液中浸泡10s，1.5%抗坏血酸溶液中浸泡10s。

2.3 不同光源类型对愈伤组织形成的影响 由图1可知，接种第3天，LED光源照明的培养瓶中外植体即开始出现褐化现象。在接种第6天，除了日光灯光源外，其他光源培养中均出现了褐化现象，植物切口开始发黑。在接种第9天，在LED灯双管光源条件下，褐化现象明显加重，褐化率达到75%，且日光灯条件下也开始出现褐化现象。在接完种12d后，出现褐化现象的外植体已经接近死亡，培养基大面积焦黑。由此可见，LED红蓝灯光源下的外植体褐化现象较严重，而日光灯管光源处理的外植体褐化现象则明显减轻。

2.4 不同激素浓度对愈伤组织形成的影响 以‘冬美人叶片为外植体，考察3种激素6-BA、NAA、2，4-D及不同浓度配比对‘冬美人愈伤组织诱导的影响，结果见表5。由表5可知，NAA和6-BA对‘冬美人愈伤组织诱导均有促进作用，而2，4-D则作用不明显。当6-BA为1.5mg/L，且NAA浓度为1.0mg/L时，诱导率最高为64%，由图2可知，诱导出的黄绿色紧密愈伤组织。因此，最佳愈伤组织诱导培养基为MS+6-BA1.5mg/L+NAA1.0mg/L。

2.5 不同活性炭浓度对愈伤组织形成的影响 在‘冬美人愈伤组织诱导研究中，外植体褐化是较常见的问题之一。如果褐化严重，会造成愈伤组织的部分死亡。因此，如何抑制褐化是‘冬美人愈伤组织诱导研究中的一个关键问题。活性炭具有吸附有害物质的能力，刘香江[5]、李凤华[6]等均使用活性炭来抑制或减缓褐化，取得了较好的效果。本研究以叶片为外植体，在MS培养基中添加活性炭的浓度分别为0、1、3、5g/L，每组接种外植体20瓶。如表6所示，添加活性炭对褐化现象有一定的抑制作用，但并不明显。

3 结论

3.1 结论 本研究结果表明：（1）最适宜的外植体是冬美人植株的叶片，以茎段为外植体诱导愈伤组织污染率高于叶片，且外植体褐化严重。（2）应采取处理Ⅴ的消毒方式，即75%酒精中浸泡5s，去离子水冲洗3次，0.1%HgCl2溶液中浸泡时间为10s，去离子水冲洗3次，1.5%抗坏血酸溶液中浸泡时间为10s，去离子水冲洗3次，吸干水备用。（3）LED红蓝灯管光源下的外植体褐化现象较严重，日光灯管光源处理的外植体褐化现象明显减弱，因此，建议采用日光灯。（4）最佳愈伤组织诱导培养基为：MS+6-BA1.5mg/L+NAA1.0mg/L，诱导率为64%。（5）添加活性炭对褐化现象有一定的抑制作用，但并不明显。

3.2 讨论 外植体诱导过程中遇到褐化现象较严重，由产生褐化的原因可知，选择适宜的外植体以及最佳培养条件，能从根本上减少褐化的发生概率。研究中采用了一些对于褐化现象常用的处理方法，例如，对于容易褐化的材料可间隔2～24h培养后，再转瓶，这样连续处理7～10d后，褐化现象会得到控制或大为减轻。在培养基中加入抗坏血酸（50～100mg/L）或柠檬酸（150mg/L）等抗氧化剂能够较有效地避免或减轻褐化现象。添加0.1%～0.5%的活性炭等吸附剂，对防止褐化也有较明显的效果。但是活性炭等吸附剂在吸附有毒物质的同时，也会吸附其他营养物质[5-7]。对于这一问题今后还需要进一步研究。

参考文献

[1]胡颖慧，马春祥，梁孝莉.松塔景天组织培养与快速繁殖的研究[J].中国林副特产，2014（2）：3-6.

[2]赵海乐，孙国庆，冯凯，等.桃美人景天的组织培养与快速繁殖[J].吉林化工学院学报，2016，33（1）：54-60.

[3]孙涛，李德森.截形十二卷的组织培养与快速繁殖[J].植物生理学通讯，2002，38（6）：586.

[4]张志斌，刘洋.假昙花的组织培养与快速繁殖[J].北方园艺，2009（2）：106-108.

[5]刘香江，杨丽，吴红芝.山葵组培中抗褐化剂的筛选及其对增殖和生长的影响[J].江苏农业科学，2018（7）：33-36.

[6]李凤华，汤绍虎，孙一铭，等.降低何首乌愈伤组织褐化研究[J].西南师范大学学报：自然科学版，2005（2）：337-340.

[7]高国训.植物组织培养中的褐变问题[J].植物生理学通讯，1999，35（6）：501-506.

（责编：张宏民）