肉苁蓉醇提取物对小鼠肾虚及糖代谢的影响

宫霞 郑丽圆 郁琳 卢必乔 王羽菲 王磊 孙兆贵

摘 要：现代药理研究表明，肉苁蓉具有抗疲劳、抗衰老、调节分泌代谢等作用。肉苁蓉醇提物对肾虚小鼠的作用研究多集中表现在激素水平，但未见对小鼠糖代谢的研究报道。为探究苁蓉醇提物对小鼠肾虚和糖代谢水平的影响，建立肾虚小鼠和糖尿病小鼠模型，连续灌胃21d后，检测肾虚小鼠血清激素水平，测定酶活力，取睾丸组织进行石蜡包埋切片和HE染色，观察其病理学状态。检测糖尿病小鼠体重、空腹血糖和总蛋白变化情况。结果表明：醇提物可使肾虚小鼠的体重增加，灌胃给药组超氧化物歧化酶（SOD）活力降低，显示醇提物有调节清除自由基的作用（p<0.001）;组织切片显示，肉苁蓉灌胃给药组的生精小管内精子数增多，表示醇提物使肾虚小鼠的生精能力提高。低剂量醇提物可显著降低雌性糖尿病小鼠的血糖水平（p<0.05），醇提物可调节糖尿病造成的总蛋白水平异常（p<0.05）。因此，肉苁蓉醇水提取物对雄性肾虚小鼠模型具有生殖改善作用，同时对糖尿病小鼠模型的血糖水平有一定的影响。

关键词：荒漠肉苁蓉;氢化可的松;肾虚;降血糖

中图分类号 R285.5文献标识码 A文章编号 1007-7731（2021）13-0023-06

Abstract： Modern pharmacological studies show that Cistanche deserticola has the functions of anti-fatigue，anti-aging，and regulating secretion and metabolism.The effects of alcohol extract of Cistanche deserticola on mice with kidney deficiency were mainly studied on hormone level，and there was almost no study on glucose metabolism in mice.In order to investigate the effects of alcohol extract from Cistanches cistola on kidney deficiency and glucose metabolism in mice，the kidney deficiency mice and diabetic mice models were established.After 21 days of continuous gavage，serum hormone levels and enzyme activity of kidney deficiency mice were detected.Testis tissues were taken for paraffin-embedded sections and HE staining to observe the pathological status.The changes of body weight，fasting blood glucose and total protein in diabetic mice were detected.The results showed that the alcohol extract could increase the body weight of mice with kidney deficiency.The activity of superoxide dismutase （SOD） decreased in the gavage group，indicating that the alcohol extract could regulate the free radical scavenging effect （p<0.01）.The number of sperms in the spermatogenic tubule of Cistanche deserticola groups was increased，indicating that the spermatogenic ability of mice with kidney deficiency was improved by alcohol extract.Low dose alcohol extract could significantly reduce the blood glucose level of female diabetic mice，and alcohol extract could regulate the abnormal total protein level caused by diabetes （p<0.05）. Cistanche deserticola alcohol water extract has reproductive improvement effects on male kidney deficiency mouse model，and has certain effects on blood glucose level of diabetic mouse model.

Key words： Cistanche deserticola;Hydrocortisone;Deficiency of the kidney;Blood sugar level

肉蓯蓉产自我国西部地区沙漠地带，是一种特殊的寄生植物，含有多种活性成分，如苯乙醇苷类、环烯醚萜类、木脂素类、多糖、氨基酸、生物碱、微量元素[1-2]等。相关研究显示，肉苁蓉除了具有调节内分泌[3]、抗疲劳[4]、润肠通便[5]、神经保护[6]等作用之外，还可以起到雄性激素的作用[7]。目前，关于肉苁蓉醇提物对肾虚小鼠的作用研究主要集中于激素水平，且国内外未见研究醇提物对小鼠血糖水平的影响，只有少数研究报道包含肉苁蓉的复方药剂具有降糖作用[8-9]。2018年4月，国家卫计委将肉苁蓉（荒漠）列为药食同源的物质，大大增加了其市场与临床应用的潜力，但目前市场上关于肉苁蓉的功能产品还不是非常知名，人们对于肉苁蓉的认识并不多，主要产品仍为肉苁蓉酒[10]、茶包一类。随着中医不断被国人所重视，中药的相关基础研究也显得尤为迫切。肉苁蓉作为我国传统的名贵中药，具有广泛的研究价值和开发应用的潜力。

本研究拟建立氢化可的松诱导的雄性肾阳虚小鼠，记录小鼠自灌胃肉苁蓉后的体重变化，测定血清激素水平和组织酶活力，对小鼠睾丸组织进行病理研究来探究肉苁蓉对肾虚小鼠的影响。建立链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠模型，检测小鼠自灌胃肉苁蓉后的体重和空腹血糖变化，以及血浆总蛋白含量，以探究肉苁蓉对小鼠糖代谢的影响，以期为肉苁蓉这一药食两用的植物资源的研究开发提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 C57BL/6J雄性小鼠和ICR小鼠，购自上海西普尔-必凯实验动物有限责任公司;链脲佐菌素，上海源叶生物公司;氢化可的松，上海源叶生物公司;野生荒漠肉苁蓉，内蒙古自治区阿拉善地区;戊巴比妥钠，Sigma公司;小鼠游离血清睾酮（T）酶联免疫试剂盒、小鼠血清促性腺激素释放激素（GnRH）试剂盒和丙二醛（MDA）酶联免疫吸附测定试剂盒，均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司;超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒，南京建成有限公司;伊红溶液（B液），上海虹桥乐翔医用试剂技术有限公司;苏木素溶液，上海虹桥乐翔医用试剂技术有限公司;通用型组织固定液，武汉赛维尔生物科技有限公司;食用乙醇，江苏省华兴生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备 MS32000LE 电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司;TDL-5-A离心机，上海安亭科学仪器厂;HH-S恒温水浴锅，江苏国胜实验仪器厂;RE-5299旋转蒸发仪，上海况胜实业发展有限公司;-80℃低温冰箱，HARRIS公司;酶标仪（MR3），赛默飞世尔（上海）仪器有限公司;欧姆龙血糖仪HGM-121，苏州尔达医疗设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肉苁蓉提取物的制备 挑选新鲜的肉苁蓉，切片，取100g粉碎，粉碎时以料液比1∶2加入蒸馏水，打成糊状匀浆，置于冰箱冷冻存放备用。将肉苁蓉匀浆和52%的食用酒精按1∶16的比例混合，65℃水浴加热46min，8000r/min离心5min后将滤渣加入同第1次等量的酒精水溶液，同等条件再次水浴加热，2次加入的乙醇水溶液共计10000mL，将2次离心出的上清液进行浓缩，使乙醇蒸发出来，浓缩条件为旋转蒸发仪85℃加热50min，得到2200mL浓缩液，即为肉苁蓉醇提取液。

1.3.2 动物模型建造及分组

1.3.2.1 肾虚小鼠动物模型 6周龄的C57BL/6J雄性小鼠引进后适应性饲养7d，随机选取5只小鼠作为空白对照组，每天进行灭菌生理盐水皮下注射，0.1mL/只，1d1次，连续10d。其余26只小鼠用氢化可的松皮下注射造模，按照25mg/kg BW（体重）的剂量连续注射10d[11-16]。小鼠如果有拱背蜷缩、肢尾冷、精神不振等肾虚症状，则认为氢化可的松诱导雄性小鼠肾虚模型造模成功。

肾阳虚小鼠模型建造成功后，空白组和模型组给予等体积的蒸馏水灌胃，低剂量组和高剂量组分别按药物临床用药量的1倍，2倍计算，1d灌胃1次，连续灌胃21d。具体分组情况为：C0空白组（5只），以0.4mL/（kg·BW）的灌胃剂量灌服纯水;M0模型组（8只）：以0.4mL/（kg·BW）的灌胃剂量灌服纯水;M1低剂量组（9只），灌胃剂量为1.6mL/（kg·BW）的肉苁蓉醇提取液;M2高剂量组（9只），灌胃剂量为3.2mL/（kg·BW）的肉苁蓉醇提取液。

1.3.2.2 糖尿病小鼠模型 8周龄ICR雌性小鼠20只，雄性小鼠21只。雌雄小鼠分别随机分为：空白组（C0），模型组（M0），肉苁蓉低剂量组（M1），肉苁蓉高剂量组（M2），每组各5只或6只，每组灌胃剂量同肾虚组。除空白组（C0）外，其余小鼠8周龄开始每日喂高脂饲料，喂28d后（11周龄）注射链脲佐菌素[17-19]120mg/（kg·BW），造模前将ICR小鼠禁食12h。72h后采血测定空腹血糖（前一晚动物禁食）。第1次测血糖未达标，12周龄重复1次实验（注射时间点、剂量均一致），空腹血糖≥11.1mmol/L视为糖尿病动物模型造模成功。

1.3.3 主要检测指标的测定 每周测量小鼠的体重，每周对ICR小鼠剪尾取血，用血糖检测系统测定空腹血糖水平，并比较各组差异。灌胃实验结束后，心脏采血，血液以3500r/min离心15min。血清分离后，用ELISA法检测C57BL/6J小鼠血清中睾酮（T）、促性腺激素释放激素（GnRH）的激素水平。小鼠断头处死后，速取睾丸组织，称重，以组织重：生理盐水（mg∶mL）=1∶0.9，离心15min，组织上清液冷冻保存备用，酶联免疫吸附测定睾丸组织丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）酶活力，操作均严格按照试剂盒说明进行。ICR小鼠每组抽取3～4个样品取其血浆送往上海实验动物研究中心，对总蛋白水平（TP）进行检测。

1.3.4 苏木素-伊红（HE）染色 小鼠取血完毕后立即处死小鼠，立即取出睾丸和附睾，将其分别精确称重。小鼠睾丸组织取材后，石蜡包埋切片，再用苏木精染液染色2min使细胞核呈蓝色，0.1%伊红染液染色2min，使细胞质呈红色。

1.3.5 统计分析 数据以平均值±标准误差（[X]±S）表示，显著性标准为P<0.05，极显著性指标为P<0.01，组间差异的统计学意义采用ANOVA（单因素方差分析）中的LSD（最小显著差法）和Duncan（多范围检验法），数据用SPSS22.0软件处理。各组数据取试剂盒灵敏度范围内的，超出范围部分的数据应舍去。

2 结果與分析

2.1 肉苁蓉醇提物对雄性肾虚小鼠的影响

2.1.1 小鼠体重的变化 由图1可知，在注射氢化可的松造模后，模型组M0的体重增长小于空白组C0，提示雄性小鼠肾虚模型建造成功，为以后的实验打下基础。给药组在10周龄之后体重出现增长，低剂量组M1的体重增长1.54g，高剂量组M2的体重增长1.09g，而空白组C0增长0.95g，提示肉苁蓉提取物可能有促进雄性肾虚小鼠体重增加的作用，但是各组之间差异不显著。

2.1.2 睾酮（T）检测结果 与模型组相比，本试验小鼠睾酮组间差异显著性为p>0.05，没有统计学意义。由图2可知，模型组M0小鼠睾酮水平与C0相比没有太大变化，与M0相比，低剂量组M1小鼠睾酮降低，高剂量组M2小鼠睾酮水平均值（2.71ng/mL）将近M0的3倍（1.07ng/mL），说明高剂量的肉苁蓉提取物对雄性小鼠的睾酮具升高作用，对肾虚小鼠的雄性激素有促进分泌的作用，而低剂量的肉苁蓉提取物却呈现对小鼠雄性激素的分泌有抑制的拮抗作用。

2.1.3 促性腺激素释放激素（GnRH）检测结果 小鼠促性腺激素释放激素各组间差异显著性为p=0.342>0.05，即本次试验小鼠各组间促性腺激素释放激素无显著性差异，不具有统计学意义。由表1和图3可知，与模型对照组M0相比，肉苁蓉提取物使给药组小鼠M1、M2的促性腺激素释放激素升高，提示肉苁蓉提取物可能促进肾虚小鼠释放促性腺激素释放激素，促进雄性激素分泌，且高剂量组M2的促进效果更强。

2.1.4 丙二醛（MDA）检测结果 经SPSS差异显著性分析得出，各组间差异显著性p>0.05，不具有统计学意义。由由表2和图4可知，模型对照组M0的丙二醛含量比空白组C0的更高，即肾虚小鼠的丙二醛含量升高，说明机体的膜脂过氧化程度升高，组织抗氧化程度降低。与M0相比，给药组M1、M2的MDA含量降低，说明肉苁蓉提取物能清除脂质氧化反应的终产物丙二醛，使膜系统得到一定程度的恢复。

2.1.5 超氧化物歧化酶（SOD）检测结果 SOD各组间差异显著性为p<0.01。由图5和表3可知，模型组M0与低剂量组M1的差异显著性为p<0.05，C0组与各组间差异显著性均为p<0.05。肾虚小鼠SOD的活力显著增加，为空白组的2.5倍，可能是由于氢化可的松这种激素引起的小鼠SOD活力的显著改变。肉苁蓉提取物对肾虚小鼠的SOD活力有一定降低作用，说明肉苁蓉提取物可以使小鼠SOD的活力趋于正常水平，说明其对小鼠体内自由基代谢状态有一定调节作用。

2.1.6 睾丸组织病理学影响 10倍光学显微镜下观察睾丸和附睾病理组织切片，其结果如图6所示。由图6可知，正常组C0小鼠睾丸生精小管基膜完整，膜内可见致密且结构正常的细胞，树枝状的支持细胞较多，生精能力强，生精小管管腔内可见大量精子。模型对照组M0小鼠生精小管基膜变薄，基膜内间质细胞排列不整齐，支持细胞减少，腔内间质出现较大空隙，腔内精子减少。与M0组相比，肉苁蓉给药组M1、M2小鼠睾丸生精小管基膜较完整，支持细胞较多，间质细胞排列较规整，精子数增多，生精小管管腔内间质的空隙相对于模型组都有一定程度的减小。

2.2 肉苁蓉醇提物对小鼠糖代谢的影响

2.2.1 肉苁蓉醇提物对小鼠体重的影响

2.2.1.1 肉苁蓉醇提物对雄性糖尿病小鼠体重的影响 在连续21d喂养高脂饲料后，雄鼠体重在不断增加。第1次和第2次注射链脲佐菌素（11周龄和12周龄）后，进行灌胃，M1组体重在实验期间不断下降（p<0.05），说明低剂量组可以显著降低糖尿病小鼠的体重，M2与M0组相比体重变化趋势基本一致（见图7）。而M0组体重与C0组相比更大，这可能是在实验过程中小鼠发育不均的原因，有待进一步研究。

2.2.1.2 肉蓯蓉提取物对雌性糖尿病小鼠体重的影响 连续21d喂养高脂饲料后，雌鼠体重不断增加，在第1次和第2次注射链脲佐菌素（11周龄和12周龄）后，所有雌鼠体重都在缓慢下降。灌胃后，与M0组相比，M1组显著降低了小鼠的体重下降率（p<0.05），M2组极显著降低了小鼠的体重下降率（p<0.01）（见图8）。2组相比，M2组的改善效果最佳。

2.2.2 肉苁蓉醇提物对小鼠空腹血糖水平的影响

2.2.2.1 肉苁蓉醇提物对雄性糖尿病小鼠空腹血糖的影响 从表4可以看出，与C0比较，M0组血糖并没有升高，说明与M0组相比，M1组在灌胃7d后空腹血糖下降8.45%，在灌胃14d后空腹血糖水平下降1.03%，在灌胃21d后空腹血糖水平下降3.58%。由此可以看出，M1组对雄性糖尿病小鼠表现出降糖作用，但差异不显著。与M0组相比，M2组在灌胃7d后空腹血糖下降2.82%，在灌胃14d后空腹血糖水平升高28.52%（p<0.05），灌胃21d后空腹血糖水平升高52.88%（p<0.01）。这可能是因为肉苁蓉提取物浓度过高而使小鼠在灌胃14d后血糖恢复到之前的水平，有待进一步研究分析。

2.3.2.2 肉苁蓉提取物对雌性糖尿病小鼠空腹血糖的影响 从表5可以看出，试验开始时，M1、M2组与M0组雌性小鼠空腹血糖含量无显著差异。与M0组相比，M1组在灌胃1周后空腹血糖升高24.66%（P<0.01），在灌胃14d后空腹血糖水平下降14.95%（p<0.01）。与M0组相比，M2组在灌胃7d后空腹血糖升高20.09%（p<0.05），在灌胃14d后空腹血糖水平下降12.77%（p<0.05），推测肉苁蓉提取物在一定时间内对血糖有显著的降糖效果。

3 讨论

（1）探究肉苁蓉醇提物对肾虚小鼠的作用研究显示，从小鼠的体重变化来看，模型组小鼠的体重增加较空白组更为缓慢。肉苁蓉醇提物灌胃给药21d后，给药组小鼠体重的增加均大于空白组和模型组，提示肉苁蓉对肾虚小鼠有一定的治疗作用。从血清激素水平来看，肉苁蓉提取物可能提高了睾丸的生精能力。超氧化物歧化酶（SOD）各组间差异显著性为p<0.01，说明肉苁蓉提取物可以调节小鼠自由基的代谢水平。从组织病理学的角度来看，观察睾丸病理组织切片，肉苁蓉给药组M1、M2小鼠睾丸生精小管管腔内间质的空隙相对于模型组都有一定程度的减小，说明肉苁蓉提取物对肾虚小鼠具有一定的治疗作用。但丙二醛、睾酮和促性腺激素释放激素水平均无显著变化，说明肉苁蓉粗提物在对这些激素的调控作用不够特异，在体综合调节作用掩盖了其疗效的显著呈现。

（2）探究肉苁蓉醇提物对小鼠糖代谢的作用研究显示，对于雌性糖尿病小鼠，与M0组相比，M1组体重显著增加（p<0.05），M2组体重极显著增加（p<0.01），说明肉苁蓉醇提物能增加糖尿病小鼠的体重。空腹血糖水平变化来看，对于雄性糖尿病小鼠，灌胃过程中，低剂量组对雄性糖尿病小鼠表现出降糖作用（p<0.05）。但M2组小鼠在灌胃两周后空腹血糖水平明显升高，这可能是肉苁蓉浓度过高引起的，有待于后续的进一步研究。对于雌性糖尿病小鼠，M1组和M2组均在灌胃两周后表现出降糖作用（p<0.05），但在灌胃21d后血糖又升高到灌胃之前的水平，推测是由于肉苁蓉醇提取物在一定时间内对血糖有显著的降糖效果，但效果不稳定。接下来，需要对不同浓度和更长时间的灌胃实验进行进一步研究，以明确肉苁蓉提取物的降血糖和改善肾虚的作用机制。

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（责编：张宏民）