暴马桑黄倍半萜合酶基因SbTps1的克隆及表达分析

乌木提?巴合提别克 唐玉倩 王淑婷 李亚伟 邹莉

摘 要：倍半萜（Sesquiterpenes）在动植物及微生物体内广泛存在，且具有重要的生理调节功能。本研究从暴马桑黄转录组数据库中筛选出1个编码暴马桑黄萜类合酶的基因，命名为SbTps1，并对其进行克隆及表达分析，经测序该基因全长1 281 bp，编码426个氨基酸，编码蛋白的相对分子质量为48.17 ku。SDS-PAGE分析结果表明，在相对分子质量69.17 ku（包含21 ku标签蛋白）附近出现与预期大小一致的蛋白条带。系统发育进化树分析表明，暴马桑黄SbTps1蛋白和嗜蓝孢孔菌Tps蛋白同源性最高;荧光定量分析结果表明，SbTps1基因转录水平在不同发育阶段有差异性，并且在菌丝发酵培养第14天时SbTps1基因转录水平达到最高状态，该结果与鲍姆纤孔菌（Inonotus baumii）倍半萜合酶基因的转录水平变化趋势相似，因此可以推测SbTps1与倍半萜合成有关，初步鉴定该基因为倍半萜合酶基因，为后续暴马桑黄倍半萜合酶基因功能的研究奠定理论基础。

关键词：暴马桑黄;倍半萜;倍半萜合酶基因;基因克隆与序列分析;原核表达;荧光定量

中图分类号：S567.3    文献标识码：A   文章编号：1006-8023（2021）04-0033-07

Cloning and Function Identification of the Sesquiterpenes Synthase Gene

SbTps1 in Sanghuangporus baumii

WUMUTI Bahetibieke， TANG Yuqian， WANG Shuting， LI Yawei， ZOU Li*

（School of Forestry， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China）

Abstract：Sesquiterpenes are widely found in plants， animals and microorganisms， and have important physiological regulatory functions. In this study， a gene encoding terpenoid synthase was screened out from the transcriptome database of Sanghuangporus baumii， named SbTps1， and its cloning and expression were analyzed. Sequence analysis showed that the full length of the gene was 1 281 bp， encoding 426 amino acids with a molecular weight of 48.17 ku. The results of SDS-PAGE showed that a protein band of the same size as expected appeared near 69.17 ku （including 21 ku labeled protein）. Phylogenetic tree results showed that SbTps1 protein and TPS protein of Formitiporia mediterranea had the highest homology. Quantitative real-time PCR analysis results showed that SbTps1 gene transcription level had differences in different development stages， and the transcription level of SbTps1 gene reached the highest state on the 14th day of mycelium fermentation culture， which was similar to the transcription level of Inonotus baumii sesquiterpene synthase gene. Therefore， it can be inferred that SbTps1 was related to sesquiterpene synthesis， and the gene was preliminarily identified as a sesquiterpene synthase gene， which laid a foundation for the further study on the function of sesquiterpene synthase gene in Sanghuangporus baumii.

Key words：Sanghuangporus baumii; sesquiterpene; sesquiterpene synthase gene; gene cloning and sequence analysis; prokaryotic expression; quantitative real-time PCR

收稿日期：2021-03-16

基金項目：中央财政林业科技推广项目（黑[2021]TG14号）

第一作者简介：乌木提·巴合提别克，硕士研究生。研究方向为食药用菌。E-mail： 1053652783@qq.com

*通信作者：邹莉，博士，教授。研究方向为食药用菌技术。E-mail： shyj@nefu.edu.cn

引文格式：乌木提·巴合提别克，唐玉倩，王淑婷，等.暴马桑黄倍半萜合酶基因SbTps1的克隆及功能初步鉴定[J].森林工程，2021，37（4）：33-39.

WUMUTI B， TANG Y Q， WANG S T， et al. Cloning and function identification of the sesquiterpenes  synthase gene SbTps1 in Sanghuangporusbaumii[J]. Forest Engineering，2021，37（4）：33-39.

0 引言

桑黄（Sanghuangporus spp.）为担子菌亚门（Ba-sidiomcota）真菌[1]。因多生长于桑属植物上，且其子实体多呈黄褐色，而得名为“桑黄”。据相关文献资料记载，桑黄具有降血糖[2]、抗氧化[3]、治疗肿瘤[4]和提高免疫力[5]等药效。桑黄具有丰富的生物学功效，是因为其内部含有萜类、多糖等成分[6]。萜类在很多生物中已经被证明具有广泛的药理活性[7-8]，桑黄萜类成分包括倍半萜、二萜和三萜等化合物，其中倍半萜类化合物种类最多。目前国内外已有大量研究证明倍半萜具有较高的利用价值，如Wawrzyn等[8]发现担子菌Omphalotus olearius合成的挥发性萜类物质illudin S在抗癌、抗肿瘤等方面具有显著的效果;倍半萜类衍生物青蒿素是我国首先发现的一种新抗疟药，具有毒性低、见效快的特点[9-10]，由此可知倍半萜对人类生命和健康都很有益。

暴马桑黄是生长于暴马丁香（Syringa reticulata var. amurensis）树上的一种大型真菌，倍半萜是其重要活性成分之一，是经过MVA途径合成的一种萜类化合物[11-12]。另外，由于倍半萜合酶的多样性决定倍半萜化合物的多样性，导致运用化学方法合成倍半萜极为困难，因此通过分子克隆、基因编辑等方式研究其合成途径中的关键酶基因，从而提高倍半萜产量，不失是一种科学可行的方法。

倍半萜合酶基因在倍半萜生物合成和代谢过程中具有重要的意义[13]。桑黄倍半萜类化合物含量的多少受到倍半萜合酶基因的调控，然而关于桑黄倍半萜生物合成途径中关键酶基因的研究却鲜有报道。本文从暴马桑黄（Sanghuangporus baumii）中克隆了一个倍半萜合酶基因，并对其进行生物信息学分析和功能研究，从而为研究SbTps1基因在倍半萜合成途径中的功能提供基础。

1 材料与方法

1.1 试验菌株与载体

本试验所用的桑黄菌种经ITS（intemal transcribed spacer）鉴定为暴马桑黄（NCBI登录号为KP974834），命名为暴马桑黄DL101、大肠杆菌（Escherichia coli）克隆菌株Top10，表达菌株BL21（DE3）和原核表达载体 pET-32a（+）于东北林业大学森林保护学科实验室保藏。

1.2 试验试剂

QuickCut EcoR I、QuickCut Hind Ⅲ、Premix Taq酶、TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）、5×In-Fusion HD試剂盒、Prime ScriptⅡ1ST、Strand cDNA Synthesis Kit和Prime ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）均购自大连Takara公司。植物总RNA提取试剂盒和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购于北京天根生化公司。质粒提取试剂盒购于上海Omega公司。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodiumdodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）试剂盒购自北京索莱宝公司。

1.3 试验引物

用于SbTps1基因克隆、检测及原核表达的引物序列见表1。

1.4 目的片段的克隆

采用植物总RNA提取试剂盒提取暴马桑黄总RNA，以反转录的cDNA为模板，SbTps1-F1、SbTps1-R1为引物进行PCR扩增。PCR产物用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行纯化回收，并检测回收产物浓度。回收产物送至哈尔滨擎科生物公司测序。

1.5 SbTps1基因序列分析

利用在线软件预测SbTps1基因开放阅读框（Open reading frame，ORF），并参考相关文献对SbTps1蛋白理化特性（ExPASy Proteomics Server）、蛋白质结构（SPOMA）、跨膜区（TMHMM）、信号肽（SignalP3.0）以及系统发育（MEGA6.0）进行预测和分析 [14-15]。

1.6 原核表达载体的构建

对pET-32a质粒进行双酶切（Quick Cut EcoRⅠ和Quick Cut Hind Ⅲ），以DNA回收试剂盒纯化回收酶切产物。将纯化后的基因片段SbTps1和线性化的pET-32a质粒以In-Fusion HD 试剂盒进行重组，将得到的pET-32a-SbTps1重组质粒转入大肠杆菌Top10感受态细胞。提取大肠杆菌Top10中转入的质粒，将PCR检测正确的阳性质粒送至哈尔滨擎科生物公司测序。

1.7 重组蛋白的诱导表达和检测

将pET-32a-SbTps1重组质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞后，采用引物pET-32a-F2、pET-32a-R2（表1）对大肠杆菌 BL21（DE3）菌落进行PCR检测，将阳性菌落接到LB液体培养基（含100 μg/mL Amp）中过夜振荡培养，取50 μL菌液加入50 mL新鲜LB液体培养基（含100 μg/mL Amp）中振荡培养，当OD600达到0.6～0.8时收集菌液做对照，然后加入IPTG（浓度为1 mmol/L）诱导表达，收集不同诱导时间的菌液进行SDS-PAGE检测。

1.8 转录水平分析

参照孙婷婷[16]的方法培养不同阶段的液体菌种、子实体及原基，之后各时间段分别提总RNA，并反转录成cDNA。以表1的α-tubulin为内参基因，qRT-PCR做3个重复。参考Livak等[17]的方法计算SbTps1基因的转录水平。

2 结果和分析

2.1 目的片段的克隆

以暴马桑黄菌种菌丝cDNA为模板，SbTps1-F1和SbTps1-R1为引物用RT-PCR技术获得SbTps1基因cDNA全长序列。扩增出的条带大小为1 281 bp，与预期的目的片段长度一致，条带清楚且特异性强。如图1所示。

2.2 SbTps1基因生物信息学分析结果

2.2.1 理化性质分析结果

SbTps1基因ORF序列及对应翻译的氨基酸序列如图2所示，据分析得到SbTps1基因cDNA序列全长为1 281 bp，编码426个氨基酸，蛋白相对分子量为48.17 ku，理论等电点5.41，氨基酸含量最高的是亮氨酸Leu（40%），

含量最低的是色氨酸Trp （1.6%），疏水性指标为-0.269，不稳定指数46.70，大于40，预测该蛋白是一个不稳定蛋白。通过NCBI的Conserved domains程序比对，得出该序列与Terpene-Cyclase-Nonplant-C1具有较高的相似性，且含1个超家族Isoprenoid-Biosyn-C1保守区，E-value值为1.36×10-42，可以推断此蛋白与暴马桑黄中的倍半萜的环化相关，结果如图3所示。

2.2.2 蛋白性质的预测分析

用TMHMM预测跨膜结构，发现SbTps1蛋白无跨膜结构，结果如图4所示;用SignalP预测信号肽，发现该蛋白无信号肽，结果如图5所示;用SPOMA对SbTps1蛋白结构预测结果为：该蛋白由α螺旋状态、延伸链、转角状态和无规则卷曲等状态组成的蛋白，其中含有49.77%的α螺旋、8.45%延伸链、1.41%的转角区和40.38%无规则卷曲状态;使用Swiss-Model预测SbTps1蛋白的3级结构，结果显示SbTps1蛋白3级结构模型是以Epi-isozizaene synthase 蛋白结构（6ofv.1.A）为模板构建的（图6）。

2.2.3 SbTps1基因系统发育分析

系统发育分析结果如图7所示，由进化树可以看出暴马桑黄Tps蛋白和嗜蓝孢孔菌Tps蛋白同源性最高，相似度达到了87.68%，可能是因为二者均是多孔菌，亲缘关系较近，可以进一步确认克隆出的基因为Tps基因。

2.3 重组质粒的构建

将SbTps1基因片段和线性化的pET-32a质粒重组后，得到pET-32a-SbTps1重组质粒。以pET-32a-F2、pET-32a-R2（表1）为引物进行PCR扩增检测。结果显示在2 000 bp（1 281 bp目的基因+上下游引物之间的碱基712 bp）附近出现特异条带，特异条带大小符合预期（图8）。通过分析阳性质粒测序后得到电子序列可知重组质粒构建成功。

2.4 SbTps1基因原核表达结果分析

将重组质粒pET-32a-SbTps1转入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞后，采用IPTG为诱导物进行诱导，SDS-PAGE结果显示如图9所示，在相对分子质量为69. 17 ku（包含21 ku标签蛋白）附近位置出现了特异蛋白带并符合预期大小，且随着诱导时间的增多蛋白量也增多。该结果可以说明重组质粒pET-32a-SbTps1构建成功并能成功表达目的SbTps1蛋白。

2.5 不同发育阶段暴马桑黄SbTps1基因转录水平变化

以SbTps1-F3、SbTps1-R3为引物（表1），采用荧光定量（qRT-PCR）技术检测SbTps1相对表达量在不同发育时期的变化趋势，结果如图10所示，SbTps1基因相对表达量在不同发育时间呈动态变化。在培养到8 d时SbTps1基因的转录水平逐渐上升，随后开始下降，在第14 d时明显上升达到最高，与其他时期呈现显著性差异，而原基和子实体时期又维持在相对较低的水平，在原基阶段基因相对表达量达到最低值，仅是14 d的7.62%。

3 讨论

倍半萜合酶基因是倍半萜合成途径中的关键基因。自从烟草中的倍半萜合酶基因被克隆[18]，陆续有包括黄花蒿、冷杉、天仙子和灵芝等30余个种物种倍半萜合酶基因被克隆和研究[19]。且有研究表明，通过基因工程技术调控次生代谢产物合成途径中关键酶基因的表达水平，可以提高其次生代谢物的产量。Chen等[20]通过过表达青蒿中的法尼基焦磷酸合酶基因，使青蒿素的含量提高4倍。

系统发育进化树分析Tps蛋白结果显示，暴马桑黄与嗜蓝孢孔菌（Formitiporia mediterranea）相似性较高，与其他真菌萜类合酶蛋白聚为一支。同时，通过NCBI比对发现，该蛋白与Agrocybe aegerita（A0A5Q0QU70.1）倍半萜合酶蛋白有64.66%的相似度，与Clitopilus sp.（BBH51500.1）倍半萜合酶蛋白相似度達66.09%。

通过SbTps1基因ORF序列推测得到氨基酸序列，对其信号肽、跨膜结构区进行预测，结果表明该序列不具有信号肽和疏水的跨膜区。该结果与灵芝倍半萜合酶蛋白和鲍姆纤孔菌倍半萜合酶蛋白结果一致[19，21]，说明暴马桑黄倍半萜合酶蛋白的结构与灵芝和鲍姆纤孔菌倍半萜合酶蛋白存在着一定相似性。

与紫芝[13]、灵芝[19]、鲍姆纤孔菌[21]等真菌相同，SbTps1基因在大肠杆菌中能够实现异源表达。通过SDS-PAGE表达分析，可以看出SbTps1蛋白产量高，表明SbTps1基因在原核表达系统中具有良好的表达效果，在后续的试验中，将对SbTps1蛋白进行提取纯化，研究其酶学特性等功能。

为检测SbTps1基因在暴马桑黄中的表达水平，利用不同发育阶段材料进行荧光定量检测[22]。结果发现SbTps1基因转录水平在不同发育阶段差异较大，在原基与子实体中该基因转录水平较低，说明在这2个阶段SbTps1基因并不活跃。菌丝发酵培养第14 天时SbTps1基因表达量达到峰值，与其他时期呈现显著性差异，其转录水平与张国权[21]报道的鲍姆纤孔菌中倍半萜合酶代谢途径中的基因转录水平变化趋势相似，在大多时期都处于相对较低水平，在某一时期会显著升高，初步鉴定克隆到的SbTps1基因为倍半萜合酶基因，该推测还有待通过转基因试验进一步研究。试验结果可为研究倍半萜合成途径鉴定基础，同时为培育高产量暴马桑黄倍半萜菌株打下理论基础。

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