玫瑰黄链霉菌和哈茨木霉IAA的测定及其发酵液对烟草的影响

张烨 杨雅雯

吲哚乙酸（IAA）是生长素中最为普遍的一种，是在植物体内自然合成、能促进细胞伸长的微量高效有机物，属于农药范畴，被广泛应用于农业领域。IAA具有调节植物生长，使细胞的体积和质量增加、促进细胞分裂和分化、调节生根等生理功能。植物体中的IAA主要来自两方面：通过色氨酸和非色氨酸前体的生物合成以及IAA结合物的水解。而微生物在代谢过程中产生的IAA主要来自于色氨酸合成途径和非色氨酸合成途径。利用IAA产生菌作为微生物肥料具有重要的生产意义。链霉菌隶属于原核生物界、放线菌目（Actinobacterales）链霉菌科（Streptomycetaceae），是具有非常复杂生命周期的革兰氏阳性菌。链霉菌以菌丝体的形式定殖于多种植物体的根、茎、叶等部位而发挥功能。链霉菌属也是一类重要的生防菌，其次级代谢产物不仅能产生各种抗生素，而且能产生植物激素类物质 。目前，已知的链霉菌产生的9000多种具有生物活性的物质中，超过120多种物质得到了应用，占微生物来源的生物活性物质应用品种数量的75%。目前已知抗生素种类有16 500种，其中51%是由链霉菌产生。链霉菌分泌的农用抗生素作为低毒、低残留的生物农药逐步受到关注。近年，关于玫瑰黄链霉菌（Streptomyces roseoflavus）的报道大多数也是农用抗生素的挖掘及其防病机制的研究，而对于微生物源植物生长调节剂开发的报道较为少见，因此我们期望能够通过分离提取玫瑰黄链霉菌菌株代谢产生的IAA来开发微生物源植物生长调节。木霉菌（Trichodermaspp）隶属于半知菌（Deuteromycotina）亚门、丝孢纲（Hyphomycetes）、丝孢目（Hyphomycetales）、从梗孢科（Moniliaceae），是世界分布性真菌。近年来，木霉菌在工业、制药业、环境保护、农业等方面都有广泛应用，是具有重要经济价值的生防菌。现在已经发现了很多具有重要价值的木霉菌，主要包括黄绿木霉（T.aureovirde）、绿色木霉（T.viride）、康氏木霉（T.koningii）等。哈茨木霉（T. harzianum）也属于木霉属的真菌，普遍存在于自然界中，其能够有效的防治镰刀菌（Fusarium）、腐霉菌（Pythium）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）等引起的植物白绢病、疫霉病、幼苗枯病等，是多种植物病原菌的拮抗菌和寄生菌，已作为生防制剂广泛用于农业领域。

我国是一个烟草大国，烟草业在国民经济中占有重要地位。自20世纪50年代末期，我国烤烟品质有所下降，主要表现是烟叶薄、油润差、香气不足、尽头小等。链霉菌和哈茨木霉在烟草上的应用有很多，链霉菌可抑制烟草上的多种病原菌，如炭疽病原菌、赤星病菌（Alternaria alternata）、花叶病毒等，哈茨木霉生防菌不仅可防治多种烟草上的病害，也对烟草的生长具有一定的促进作用。烟草种子萌发和幼苗生长是烤烟优质高产栽培的基础，提高种子萌发率，增强幼苗生长能力对提高烟叶质量意义重大。本文研究玫瑰黄链霉菌（Streptomyces roseoflavus）和哈茨木霉（T. harzianum）菌株发酵液对烟草种子萌发和烟苗生长的作用，可为烟草生产中利用生防菌剂及生物菌肥提供理论依据。

一、材料与方法

（一）材料

供试菌株玫瑰黄链霉菌、哈茨木霉由河南科技大学园艺与植物保护学院植物病理实验室保存。供试烟草品种为LY1306，由河南省烟草公司洛阳市分公司提供。培养基为大豆酵母培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）。

（二）方法

1.菌株发酵液的制备。将保存的玫瑰黄链霉菌和哈茨木霉菌株分别接种在高氏1号培养基、PDA培养基上，于28 ℃下分别培养4～5 d、5 d，用打孔器分别在分离纯化培养的玫瑰黄链霉菌、哈茨木霉菌菌落边缘打孔，制成菌饼。每100 mL大豆酵母培养基接入5个玫瑰黄链霉菌菌饼，每100 mL真菌液体培养基打入3～4个哈茨木霉菌饼。均置28℃恒温培养箱180 r/min下振荡培养4～5 d，进行种子初步扩繁，制备摇瓶种子液。分别取4%种子液接种于100 mL大豆酵母液体培养基、真菌液体培养基中，另按1%接种量需要加入500 μL色氨酸标准值，在每100 mL大豆酵母液体培养基、真菌液体培养基中分别加入2 mL色氨酸，28 ℃下220 r/min分别摇培7 d、5～6 d，得到待测菌株发酵液。

2.菌株发酵液中IAA的测定。

（1）制作IAA标准曲线。取0.05g的IAA标准品，用50 mL容量瓶定容成1000 mg/L母液。分别取250 mL、500 mL、750 mL、1000 mL、1250 mL母液配成10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L工作液。上述溶液分别取2.5 mL加入等体积Salkowski比色液，用5 mL容量瓶定容。室温避光静置30 min后取出立即用分光光度计测定其OD535值，以加入了比色液的培养基调零，重复3次。以IAA浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

（2）IAA定性检测。取1mL悬浮菌液8000 r/min離心5 min，取100 μL上清液滴于白色陶瓷板中并与等体积的Salkowski比色剂混合进行显色反应。同时以50 mg/L的IAA标准品溶液100 μL为阳性对照，以不加菌的培养基为阴性对照。室温避光放置30 min，观察颜色变化，颜色变为粉红色表示有IAA产生。

（3）IAA定量检测。取菌株发酵液10 mL，8000 r/min离心5 min。取5 mL上清液等体积加入Salkowski比色液，用10 mL容量瓶定容。以未接菌的发酵培养基与Salkowski比色液等体积混合作对照。室温避光静置30 min，测定OD535值，根据IAA标准曲线，计算发酵液中IAA的含量。

3.菌株发酵液促生效果的测定。

（1）处理液的制备。制备的菌株发酵液与无菌水混合，配制成10%、20%、30%、40%、50%和60%不同浓度梯度，分别装在三角瓶中，在4℃冰箱中保存。

（2）烟草种子的处理。选取大小均一的种子，先用70%酒精和1%次氯酸钠分别处理5 min、1 min，再用无菌水冲洗3次。种子干燥后放在不同浓度的菌株发酵液中浸泡12 h，无菌水作对照（CK）。浸泡后的种子晾干后均匀置于铺有两层滤纸的培养皿（加相应处理液5 mL）中，置25 ℃光照培养箱中培养，随后定时统一补加处理液。每处理50粒种子。重复3次。注意保持发芽试验过程中的足够水分，种子四周的相对湿度应在90%～95%。

（3）烟草种子发芽势和发芽率的测定。种子分别处理7 d、14 d后记录发芽数，以胚根伸出与种子等长时为发芽标准。发芽势（%）=（7 d内发芽种子粒数/受检种子数）×100，发芽率（%）=（14 d内全部发芽种子粒数/受检种子数）×100。

（4）菌株对烟苗生长的影响。选取大小均匀一致的种子播种，生长25 d后，选取长势和叶片大小相对一致的烟苗栽在装有基质的营养钵内（基质填满钵高的2/3，基质成分是土壤与草炭土，比例为1：1），

每钵1株。放在一个育苗盘中的12株烟苗分别用玫瑰黄链霉菌菌株、哈茨木霉菌株发酵液浇灌，每钵浇10 mL;9株烟苗用自来水浇灌作对照，每钵浇10 mL。育苗盘在开始处理时浇上水，水的高度为1～2 cm。处理后的烟苗其生长需在室温且相对湿度90%～100%育苗室中进行。处理后的烟苗在营养钵中培育14d后测定其新生并展开的两片叶（正一叶、正二叶）的长度（叶尖到茎基部）和叶宽（叶片最宽处）。在烟苗生长过程中要定期在育苗盘中浇水，控制其外部生长条件的一致，且要及时清除一些烂叶和杂叶。在育苗室定期交换烟苗位置，使每一株烟苗所接受的光照是均匀和充分的。

二、结果与分析

（一）IAA标准曲线

通过Salkowski比色试验，确定了玫瑰黄链霉菌和哈茨木霉代谢的过程中可以产生吲哚乙酸（IAA），以吸光值OD535为纵坐标（y），IAA的浓度为横坐标（x）制作标准曲线（图1），并得到线性回归方程y=0.043 1x-0.366 6，R2=0.997 7。

（二）菌株发酵液中IAA的含量

根据所制的标准曲线得到玫瑰黄链霉菌基础发酵液中IAA的含量是9.60 mg/L，哈次木霉基础发酵液中IAA的含量是12.03 mg/L（表1）。

（三）菌株发酵液的促生效果

1.玫瑰黄链霉菌发酵液对烟草的促生效果。由表2可看出，玫瑰黄链霉菌菌株发酵液浓度在10%～60%时的发芽势和发芽率都高于或等于CK，但浓度大于40%时其整体烟草种子的发芽势是趋于下降的，而发芽率和对照的持平。表明玫瑰黄链霉菌菌株发酵液具有促生能力。菌液对烟草种子萌发的促进作用最显著的浓度是20%和30%，在菌液浓度大于40%时其促生作用减弱。说明较高浓度的菌株发酵液会表现出对烟草种子萌发的抑制作用。

2.哈茨木霉发酵液对烟草的促生效果。从表3可知，菌液浓度10%～40%时的烟草种子发芽势都高于CK，但浓度在50%和60%时烟草种子的发芽势低于CK。菌液浓度在10%～60%时的烟草种子发芽率都高于CK，但浓度大于30%时发芽率是逐渐下降的。表明哈茨木霉菌株发酵液对烟草种子的发芽具有促进作用，促进作用在菌液浓度为30%时最为显著。

3.在一定浓度下的玫瑰黄链霉菌、哈茨木霉菌株发酵液对烟草种子的发芽有促进作用，而高浓度对烟草种子的发芽表现出现抑制作用。

（四）菌株发酵液对烟苗生长的影响

从表4可以看出，对照组烟苗在14 d内的长势均较好，正一叶的平均长度都在12.8 cm、宽度6.7 cm，正二叶的平均长度接7.6 cm，宽度接近4 cm。用玫瑰黄链霉菌菌株发酵液处理后的烟苗叶片大于对照组的正一叶的长度和宽度，但是这种促进作用在烟苗14 d的生长期内表现的不是特别显著。用哈茨木霉菌株发酵液处理的烟苗正一叶和正二叶的长度和宽度均小于对照组的，表明哈茨木霉菌株发酵液在此用量下对烟苗生长没有促进进用，甚至会对烟苗的生长表现出抑制的作用。

三、结论

玫瑰黄链霉菌和哈茨木霉發酵液IAA的产量分别为9.60 mg/L、12.03 mg/L。玫瑰黄链霉菌培养液浓度在20%和30%时对烟草促生作用较为明显，大于40%对烟草种子萌发有抑制作用;哈茨木霉培养液浓度在30%时对烟草促生作用最为明显，大于30%时对种子萌发有抑制作用。两种菌的发酵液处理烟苗14 d后，经玫瑰黄链霉菌发酵液处理的烟苗正一叶的长度与宽度大于对照，在本试验浓度范围内对烟苗生长具有一定的促生作用;哈茨木霉菌株发酵液处理的烟苗正一叶和正二叶的叶片长度和宽度接近甚至小于对照，在浓度范围内对烟苗生长几乎无促生作用。