磐龙玉及磐龙墨玉的矿物元素分析及磐龙墨玉提取物肿瘤细胞毒活性初探

王 力 刘梦璠＃ 郑昌武* 席志超* 张 彤

（1.上海中医药大学中药学院，上海201203； 2.上海中医药大学教学实验中心，上海201203）

矿物药在我国应用历史悠久，迄今为止各种典籍中有记载的矿物类药材已多达370 余种［1］，是我国中医药宝库中重要的组成部分之一。《山海经》 是最早记载矿物药的著作，其中记载了60 余种矿物类药材［2］；2020年版《中国药典》 中，收录23种矿物药［3］。

玉石是一类天然矿物药。《神农本草经》 中将玉石分为上下两部，最早记载了玉石的药用价值为“玉是阳精之纯者，食之以御水气。”《本草经集注》 将玉石分为上中下三品，记载玉屑，味甘性平、无毒，主除胃中惹、喘息、烦满，止渴［4］。磐龙玉因产自吉林省磐石市龙岗山脉而得名，根据颜色和质地的不同，该玉石又可进一步分为“磐龙墨玉”“磐龙玉”［5］。目前已有专业的地质研究人员对其矿物学特征、结构特征、矿物成分、化学成分、地质成因等做了较为详尽的考察。磐龙玉含有多种矿物质，如云母，石英，绿泥石及方解石等［6］。这些矿物组成很早被祖国的古医籍收录，积累了大量的医疗实践经验。《本草纲目》中记载，云母石有安神镇惊、纳气坠痰、止血敛疮功效。可用于治疗心悸、失眠、眩晕、癫痫、虚喘、寒疟、久痢、金创出血、痈疽疮毒、湿疹。而白石英有温肺肾、安心神、利小便的功效。可治肺寒咳喘、阳痿、消渴、心神不安、惊悸善忘、小便不利、黄疸、石水、风寒湿痹等症［7］。《证类本草》 中描述紫石英有镇心、安神、降逆气、暖子宫功效。可用于心悸、怔忡、惊痫、肺寒咳逆上气、女子宫寒不孕［8］。现代药理学研究表明雄黄、胆矾、硝石等矿物药对肿瘤细胞有较强的抑制作用［9⁃11］。研究还表明云母石还可通过抑制NF⁃κB 活性，下调炎症因子TNF⁃α 表达和提高修复因子EGF 水平等通路，起到抑制结肠炎的作用［12⁃14］。因此对磐龙（墨）玉的元素成分以及初步的肿瘤细胞毒活性研究有助于了解该类矿物的药用价值。

本研究采用微波消解⁃电感耦合等离子体质谱法对磐龙玉及磐龙墨中的微量元素进行含量测定［15⁃17］。通过MTT 法测定磐龙墨玉乙醇、甲醇和水提取物的细胞毒活性［18⁃19］，以期探讨磐龙玉的潜在药用价值。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 7700X 电感耦合等离子体质谱仪（美国Agilent 公司）；全能型微波化学工作平台（上海屹尧仪器科技发展有限公司）；梅特勒ME204／02分析天平（瑞士梅特勒公司）；G⁃400 智能温控电加热器（上海屹尧仪器科技发展有限公司）；Master⁃S30UV 纯水仪（上海和泰仪器有限公司）；光学倒置显微镜（日本OLYMPUS 公司）；二氧化碳培养箱（日本SANYO 公司）；多功能酶标仪（美国PerkinElmer 公司）。

1.2 试剂与药物 混标试剂标准品（包含41种元素，国家有色金属及电子材料分析测试中心，国标（北京）检验认证有限公司联合研制）。超纯水、硝酸、盐酸、氢氟酸等。RPMI⁃1640、DMEM 培养基（美国Gibco 公司）；胎牛血清（以色列Biological Industries 公司）；噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT，美国Sigma 公司）；DMSO（美国Sigma 公司）。人胰腺癌细胞MIA PaCa⁃2、人宫颈癌细胞HeLa、人肝癌细胞Hep G2、人肺癌细胞A549、人乳腺癌细胞MDA⁃MB⁃231、小鼠黑色素瘤细胞B16F10、人黑色素瘤细胞A375、人食管癌细胞Eca109 购自中国科学院细胞库，人前列腺癌细胞LNCaP、PC⁃3 购自美国ATCC细胞库。磐龙墨玉样品1～4号，磐龙玉样品5～12号，均采自吉林省磐石市龙岗山脉（吉林省三河矿业开发有限公司）。

2 方法与结果

2.1 元素分析

2.1.1 样品消解 取样品0.1～0.3 g，加入聚四氟乙烯消解罐中；向聚四氟乙烯的消解罐中加入6 mL 硝酸，3 mL盐酸，2 mL 氢氟酸，将消解罐置于消解支架上，放入微波消解仪中，消解程序见表1。

表1 消解程序

确认消解罐中样品已全部消解完毕；冷却至室温，取出加入1 mL 高氯酸，将消解罐转移到智能温控电加热器，进行赶酸处理，赶酸温度150 ℃；待消解罐中液体剩余1 mL左右，移出消解罐，室温冷却；待消解罐冷却后，将剩余液体转移至50 mL 量瓶中，并用超纯水清洗消解罐3～4 次，清洗液转移至量瓶中，用超纯水定容待测。

2.1.2 样品元素分析仪器参数 仪器工作之前，进行自动调谐、质量校正、检测器校正等设定工作参数，以灵敏度、背景、稳定性等各项指标对仪器的工作参数进行优化，保证仪器获得最佳的灵敏度和精确的质量准确度。等离子体质谱中的干扰可分为2 大类：“质谱干扰”和“非质谱干扰”或称“基体效应”。质谱干扰又可分为双电荷离子干扰；同量异位素重叠干扰；多原子离子干扰；难熔氧化物干扰等。ICP⁃MS 自动调谐的工作参数和分析过程的工作参数见表2～3。自动调谐过程能够在一定程度上消除上述干扰。

表2 ICP⁃MS 调谐主要工作参数

表3 ICP⁃MS 主要工作参数

2.1.3 检测结果 本次检测总计12 批样品，编号1～4 为磐龙墨玉，编号5～12 为磐龙玉，来源于不同矿井或同一矿井的不同深度。结果见表4。

表4 各元素ICP⁃MS 检测结果（mg／kg）

检测结果表明磐龙玉和“磐龙墨玉”样品中含有多种矿物元素，与云母、石英、绿泥石的元素成分基本相同。为便于比较分析，本实验把磐龙玉、磐龙墨玉所含元素数量值计算平均值，结果见表5。

表5 样品中各元素平均含量（mg／kg）

表5 显示，4 份磐龙墨玉样品中含有Li、As、B、Ba、Cr、Se、Cu、Mo、Ni、P、Pb、Cd、Sn、Sr、V、Zn、Zr 元素，其中一份磐龙墨玉中检测出少量的 Hg 元素（0.03 mg／kg），磐龙墨玉中元素平均含量由高到低依次是Ba、P、B、Pb、Zr、Zn、V、Sr、Cr、Ni、Mo、As、Sn、Li、Cu、Se、Cd、Hg。8 份磐龙玉样品中含有As、B、Ba、Cr、Se、Cu、Mo、Ni、P、Pb、Cd、Sn、Sr、V、Zn、Zr 元素，其中一份样品的Sn 元素（1.97×103mg／kg）含量远高于其他样品。磐龙玉中元素平均含量由高到低依次是Sn、Ba、B、Zr、P、Sr、Zn、As、Pb、Mo、Cr、Ni、V、Cu、Cd、Se。磐龙玉和磐龙墨玉二者所含元素差异不大。

为了探究磐龙玉和磐龙墨玉是否具有潜在的矿物药用价值，本实验初步检测了其潜在的抗肿瘤活性。因二者所含元素差异不大，选取磐龙墨玉为研究对象，分别用甲醇、乙醇、水进行提取，并对其提取物进行肿瘤细胞毒活性检测。

2.2 细胞毒性实验

2.2.1 样品制备 称取150 mg 的磐龙墨玉样品（2号）于50 mL 的离心管中，加入5 mL 提取溶剂（甲醇、乙醇水），超声提取2 h。4 000 r／min 离心30 min，取上清液经0.22 μm 微孔滤膜过滤，旋干。用1 mL 提取剂复溶于1.5 mL EP 管中，减压干燥。

2.2.2 MTT 法 取对数生长期细胞，调整密度为2×105个／mL，用含10% 胎牛血清的RPMI⁃1640 或DMEM 培养基将细胞接种于96 孔板中于37 ℃、5% CO2及饱和湿度的培养箱中培养24 h，待细胞贴壁后，按照分组加入含药培养基100μL。共分为7组，DMSO 对照组、磐龙墨玉甲醇提取物组（100 μg／μL）、磐龙墨玉乙醇提取物组（100 μg／μL）、磐龙墨玉水提取物组（100 μg／μL）、二氧化硒（15 μmol／L）和多西他赛（1 μmol／L），置培养箱培养48 h。向各孔细胞中加入10 μL 的MTT（5 g／L），孵育4 h后吸弃上清，每孔再加入100 μL DMSO，振荡混匀后，用酶标仪（波长为570 nm）测定各孔OD值，记录结果并计算细胞增殖率，实验重复3 次。细胞增殖率＝（OD值各实验组－OD值空白组）／（OD值对照组－OD值空白组）×100%。

2.2.3 统计学分析 实验数据采用Excel 2020 软件及SPSS 16.0 统计软件进行分析，并计算肿瘤细胞生长的半数抑制浓度IC50，用GraphPad Prism 软件进行作图，最终结果以平均值±标准误差的形式表示。多组间数据的比较采用单因素方差分析（one⁃way ANOVA），以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2.2.4 结果

2.2.4.1 细胞毒活性比较 为检测磐龙墨玉不同溶剂提取物对肿瘤细胞生长的抑制作用，本实验分别在10种肿瘤细胞株上测定了细胞毒活性。结果见图1，磐龙墨玉的甲醇、乙醇提取物（100 μg／μL）体外作用48 h 对人胰腺癌细胞MIA PaCa⁃2、人宫颈癌细胞HeLa、人肝癌细胞Hep G2、人肺癌细胞A549、人乳腺癌细胞MDA⁃MB⁃231、小鼠黑色素瘤细胞B16F10、人黑色素瘤细胞A375、人食管癌细胞Eca109、人前列腺癌细胞LNCaP、PC⁃3 的细胞增殖均具有明显的抑制作用（P＜0.001），且乙醇提取物的细胞毒作用强于甲醇提取物。通过进一步比较磐龙墨玉甲醇及乙醇提取物对不同细胞株增殖率的影响，发现黑色素瘤细胞B16F10 和A375 对磐龙墨玉甲醇及乙醇提取物最为敏感，表明磐龙墨玉对黑色素瘤具有一定的选择性。

图1 磐龙墨玉提取物对不同细胞株增殖率的影响

水提取物的抑制作用相对较弱，仅在 LNCaP、B16F10、A375、HeLa、Hep G2 和Eca109细胞上显示出较弱的肿瘤细胞毒活性。阳性对照药二氧化硒和多西他赛在不同种类的细胞中表现出不同程度的抑制作用（P＜0.001）。以上结果表明，磐龙墨玉的乙醇提取物具有一定的广谱细胞毒活性，其有效成分值得进一步探索。

2.2.4.2 抑制黑色素瘤细胞的增殖 进一步检测了不同浓度的磐龙墨玉甲醇和乙醇提取物对黑色素瘤细胞B16F10 和A375 的抑制作用，并测定了半数抑制生长所需的浓度（IC50）。结果见图2，不同浓度的甲醇、乙醇提取物（25、50、75、100 μg／μL）作用于B16F10 和A375细胞48 h，随着浓度的增加，抑制作用逐渐增强。磐龙墨玉的2种醇提物对黑色素瘤细胞的IC50值见表6。以上实验结果表明，磐龙墨玉的甲醇和乙醇提取物可有效地抑制黑色素瘤细胞的增殖，且呈剂量依赖关系。

表6 磐龙墨玉各提取物对黑色素瘤细胞的IC50值（，μg／μL）

表6 磐龙墨玉各提取物对黑色素瘤细胞的IC50值（，μg／μL）

3 讨论与结论

本课题采用的ICP⁃MS 方法，能准确分析矿物中所含元素的种类和含量，在研究矿物药的组成、元素含量及品种差异等方面应用广泛，因此是评价矿物药安全性及其质量的重要依据［20］。采用该方法，全正香等［21］测定了藏药南寒水石样品中的金属元素成分，其中含有大量Ca、Si、Mg、Fe、Al、Na、K、Zn、Mn、Pb、As、Hg 等元素。胡莲［22］比较了琥珀等8种矿物类中药传统饮片和其配方颗粒中微量元素Pb、Cu、Mn、Ni、Cr、Zn、As、Sb、Cd 的含量差异，指出Mn 元素与镇惊安神药治疗心神不宁、头晕目眩等肝阳上亢之证有关。周杰等［23］对生龙骨、煅龙骨、生牡蛎、煅牡蛎、生石膏、滑石6种矿物药进行了微量元素测定，得出6种矿物类中药均含有人体必需微量元素Mn和Zn，而滑石中含有较大量的Mn、Ni、Cr。本研究初步对磐龙玉和磐龙墨玉进行了元素分析，磐龙玉和磐龙墨玉中含有As、B、Ba、Cr、Se、Cu、Mo、Ni、P、Pb、Cd、Sn、Sr、V、Zn、Zr 等多种矿物元素，两者所含元素种类基本一致，所存在的差别为磐龙墨玉中还检测到含有Li 元素，个别编号的磐龙墨玉还含有微量的Hg 元素。磐龙玉中元素平均含量由高到低依次是Sn、Ba、B、Zr、P、Sr、Zn、As、Pb、Mo、Cr、Ni、V、Cu、Cd、Se；而磐龙墨玉中元素平均含量由高到低依次是Ba、P、B、Pb、Zr、Zn、V、Sr、Cr、Ni、Mo、As、Sn、Li、Cu、Se、Cd、Hg。总体来看，二者所含元素种类差异不大，但元素含量比例有所不同。磐龙玉和磐龙墨玉中所含有的As、Cr、Se、Cu、Mo、Ni、Cd、Sn、Sr、V、Zn 等元素已被确认在人体中具有特殊的生理功能［24］。

在元素分析的基础上，进一步的细胞实验证实磐龙墨玉的甲醇和乙醇提取物对10种肿瘤细胞株均具有一定的细胞毒活性，而磐龙墨玉的水提取物对肿瘤细胞的细胞毒活性较弱。其中磐龙墨玉的甲醇和乙醇提取物对黑色素瘤细胞B16F10 和A375 的细胞毒活性最强，可呈浓度依赖的抑制黑色素瘤细胞的生长。但提取物中究竟是何种成分在发挥作用以及这些成分抗肿瘤作用的确切机理还有待进一步研究。磐龙玉和磐龙墨玉中富含多种与人体生理功能相关的微量元素，微量元素在中药的药效及安全性方面起着重要作用［25］。通过该研究，初步确认了磐龙墨玉具有一定的肿瘤细胞毒活性，以期在一定程度上丰富矿物药的研究类型和方法，同时为进一步研究磐龙玉和磐龙墨玉提供了科学依据。