兔源支气管败血波氏杆菌和肺炎克雷伯菌的分离鉴定及其对抗菌药物的敏感性分析

张自强,王佳佳,任玉莹,朱慧杰,张倩文,刘玉梅

(河南科技大学动物科技学院，洛阳 471000)

支气管败血波氏杆菌病和肺炎克雷伯菌病是兔的常发病。支气管败血波氏杆菌病是支气管败血波氏杆菌(Bordetellabronchiseptica)引起的一种多发性呼吸道传染病，哺乳仔兔和断乳仔兔主要表现急性死亡，成年兔主要表现鼻炎、支气管炎和脓疱性肺炎等呼吸道疾病[1-3]。该病在季节交替且温差大时多发，各品种、各年龄段的兔均可发病。兔肺炎克雷伯菌病是由肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)引起的一种是以肺炎和其他器官化脓性炎症为主要表现的呼吸道传染性疾病，具备发病率高和死亡率高的特点。

近年来，随着我国养兔业的快速发展，规模化兔场迅速增多，我国养兔业的发展盛况空前。河南省是养兔大省，家兔养殖规模庞大。目前，影响河南养兔业发展的首要因素是疾病问题，诸如流行性腹胀腹泻、传染性鼻炎及球虫病等的发病率和死亡率较高，给养殖场(户)造成较大的经济损失[4-6]。细菌性疾病中，支气管败血波氏杆菌病和肺炎克雷伯菌病近年来在兔群里经常发生。当兔的生活环境发生变化(如天气、温度变化，食物突然更换，饲养场所变化以长时间处于应激状态等)时，B.bronchiseptica易引起以鼻炎为主要表现的呼吸道疾病，若与K.pneumoniae混合感染，危害更为严重。由于二者的临床表现与病理变化较为相似，仅通过症状、病理剖检、镜检等手段很难区分，常被误诊为单一细菌感染。本研究拟从病兔组织分离病原，通过PCR鉴定、基因测序及药敏试验，确定常用抗菌药物的耐药谱，为科学用药，预防控制该2种病菌感染提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源

2019年8—9月，河南省某兔场50～60日龄兔，连续出现打喷嚏，鼻腔有白色或黄色黏液，并伴有明显腹泻症状为主要特征的疾病，且病兔大量死亡。临床观察发病兔，剖检并无菌采集病死兔肝、肺、气管、肾、盲肠等组织，待进行病原菌的分离培养及检测。

1.2 主要试剂与仪器

培养基(普通琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基)、药敏纸片购自北京索莱宝科技有限公司。PremixTaqTM(ExTaqTMVersion 2.0 plus dye)购自大连TaKaRa公司。细菌基因组DNA小量提取试剂盒、Proteinase K、DL2000 DNA Marker购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司。溴化乙锭溶液购自苏州天可贸易有限公司。

主要仪器：台式冷冻高速离心机(Beckman Coulter)、普通PCR仪(Applied Biosystems 2720)、凝胶成像系统(BIORAD)、电泳仪(北京市六一仪器厂)。

1.3 病原菌的分离纯化

取“1.1”采集的肝、肺、气管、肾、盲肠等组织样品，分别接种于普通营养琼脂培养基，37 ℃培养24 h，观察菌落的生长情况。随后挑取疑似单个菌落于麦康凯琼脂平板上纯化，并对纯培养细菌进行常规革兰染色，镜检。

1.4 生化试验

将分离菌纯培养物分别接种到微量生化管，37 ℃ 培养24～48 h，观察并记录结果。

1.5 引物设计与合成

选择GenBank中收录的B.bronchiseptica16S rRNA基因序列和K.pneumoniae的16S rRNA基因序列，经DNAStar软件对比分析，利用Primier 5.0软件设计相应引物。引物由通用生物系统(安徽)有限公司合成，具体序列及目的片段的信息见表1。

表1 引物信息

1.6 分子生物学鉴定

取分离纯化后的菌液，按照细菌基因组DNA小量提取试剂盒说明书的操作步骤的提取细菌DNA，以菌液的核酸为模板，分别进行波氏杆菌的16S rRNA和肺炎克雷伯菌16S rRNA基因的PCR扩增。25 μL反应体系：DNA模板 1 μL，PremixTaqTM12.5 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL。反应条件：94 ℃变性 4 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，由通用生物系统(安徽)有限公司进行测序，将测序结果与GenBank中已登录的菌株进行同源性比对分析，并利用MEGA7.0构建系统进化树。

1.7 动物回归试验

将2株分离菌分别接种于普通营养培养基，37 ℃ 培养24 h后用平板法进行细菌计数，稀释菌液浓度至109CFU·mL-1。将12只体重20 g左右SPF级KM小鼠随机分为3组，每组4只，第1、2组每只小鼠分别腹腔注射稀释好的2株菌液，每只小鼠腹腔注射0.2 mL，对照组小鼠注射相同剂量的PBS。相同环境下饲养，接种后观察，对病死鼠进行剖检。

1.8 药敏试验

根据美国临床检验标准委员会(NCCLS)推荐的K-B纸片法进行试验操作和结果判断[7]。抗生素纸片包括：红霉素、庆大霉素、新霉素、麦迪霉素、四环素、卡那霉素、多西环素、复方新诺明、多黏菌素B、诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、哌拉西林、氨苄西林、羧苄西林、丁胺卡那霉素、头孢拉定、头孢曲松、头孢他啶、头孢氨苄、头孢哌酮、头孢唑啉。

2 结 果

2.1 临床剖检

临床剖检发现病死兔气管充血、出血，管腔内有黏性或脓性分泌物(图1 A)。肺稍肿大，有出血点，有大小不等的脓肿，脓包内积满黏稠乳白色脓汁(图1 B)。胸腔内充满大小不等的脓肿(图1 B)。肝内以及心表面附着大量脓肿(图1 C)。肾表面也可见积脓(图1 D)。肠黏膜充血、出血，盲肠黏膜充血、出血最严重，肠腔有黏稠物和大量气体(图1 E)。病兔剧烈腹泻，排褐色糊状稀粪，肛门以及后肢周围被毛被污染(图1 F)。

2.2 形态及培养特性观察

经细菌分离培养，从8只病死兔肝、肺、气管、肾、盲肠等组织中分离到10株细菌，其中5株菌体形态特征、培养特性、生化特性和药物敏感性一致，另外5株菌体形态特征、培养特性、生化特性和药物敏感性一致，因此判定此次分离得到两种不同的细菌且都为混合感染。细菌1在普通琼脂上生长后，形成光滑、湿润、烟灰色、半透明、隆起的中等大小菌落(图2A)，在麦康凯琼脂平板上生长良好，能形成圆形、光滑、突起、不透明的乳白色大菌落(图2B)。革兰染色镜检可见革兰阴性，两端钝圆、两极着色，大部分分散，少数成对存在的小杆菌(图2C)。细菌1在普通琼脂上长出乳白色、湿润、闪光、凸起、丰厚、黏稠的大菌落(图2D)，在麦康凯琼脂平板上生长出粉红色菌落(图2E)。革兰染色镜检可见短粗、呈卵圆形的革兰阴性杆菌(图2F)。

2.3 生化试验

细菌1和细菌2理化性质见表2。细菌1和细菌2理化性质符合B.bronchiseptica和K.pneumoniae的生化特性。因此，据分离菌形态、培养特性及表2生化特性分析结果，初步判定此次分离培养菌为B.bronchiseptica和K.pneumoniae。

2.4 分子生物学鉴定

经2%琼脂糖凝胶电泳，自肝、肺、气管、肾、盲肠等样品分离到的两种细菌分别约在1 492(图3A)和1 494 bp(图3B)处出现特异性条带。分别将两种扩增产物的测序结果经NCBI(blast)分析，采用DNAStar软件中MegAlign进行多序列比对，采用Mega 7.0软件分别构建其遗传进化树，结果显示细菌1与B.bronchiseptica菌株AU 12671等相似性为99.85%(图4A)，细菌2与K.pneumoniae菌株F5feb.57等相似性为100%(图4B)。

A．气管；B.肺；C.心、肝；D.肾；E.肠；F.肛门A. Trachea; B. Lung; C. Heart and liver; D. Kidney; E. Intestine; F. Anus图1 病死兔剖检Fig.1 Dissection of sick and dead rabbits

A.细菌1在普通琼脂培养基上的菌落形态；B.细菌1在麦康凯琼脂培养基上的菌落形态；C.细菌1革兰染色(1 000×)；D.细菌2在普通琼脂培养基上的菌落形态；E.细菌2在麦康凯琼脂培养基上在的菌落形态；F. 细菌2革兰染色(1 000×)A. Colony morphology of bacterium 1 on ordinary agar medium; B. Colony morphology of bacterium 1 on McKangkai agar culture medium; C. Bacterium 1 Gram stain(1 000×); D. Colony morphology of bacterium 2 on ordinary agar medium; E. Colony morphology of Bacterium 2 on McKangkai Agar culture medium; F. Bacterium 2 Gram stain(1 000×)图2 2株分离菌的形态和培养特性观察Fig.2 Observation on the morphology and culture characteristics of the two isolated bacteria

表2 生化试验结果

A. 细菌1；B. 细菌2; M.DL2000 DNA相对分子质量标准；1.肝；2.肺；3.气管；4.肾；5.盲肠A. Bacterium 1; B.Bacterium 2; M.DL2000 DNA marker; 1.Liver; 2. Lung; 3.Trachea; 4.Kidney; 5.Cecum图3 分离菌16S rRNA PCR扩增电泳图Fig.3 16S rRNA PCR amplification electrophoresis of the isolated bacteria

2.5 动物回归试验

用2株分离菌攻毒后，第1、2组试验小鼠均表现为精神沉郁，厌食昏睡，48 h内全部死亡，而对照组小鼠表现正常。剖检病死小鼠发现注射支气管败血波氏杆菌组小鼠肝淤血、肿大；脾淤血、肿大；肠道、肠系膜等出血。注射肺炎克雷伯菌组小鼠肝淤血、肿大；脾充血、淤血；肠道内充满黄绿色内容物。取死亡小鼠肝接种普通营养琼脂平板培养，分离的菌落特征和染色镜检结果均与原分离菌株一致，16S rRNA的PCR鉴定证实序列与原分离株相同。

2.6 药敏试验

将该B.bronchiseptica和K.pneumoniae分别接种到含抗生素的培养基上，测量抑制圈的直径。B.bronchiseptica对不同药物的敏感性见表3。由表3可知，B.bronchiseptica对庆大霉素、头孢曲松、头孢唑啉三种药物敏感，对多黏菌素B、头孢哌酮不敏感，对红霉素、新霉素、麦迪霉素、四环素、卡那霉素、多西环素、复方新诺明、诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、哌拉西林、羧苄西林、丁胺卡那霉素、头孢拉定、头孢他啶、头孢氨苄17种药物有较强抗性；K.pneumoniae对不同药物的敏感性见表4。由表4可知K.pneumoniae对庆大霉素、头孢曲松、头孢氨苄、头孢唑啉四种药物敏感，对头孢他啶不敏感，对红霉素、新霉素、麦迪霉素、四环素、卡那霉素、多西环素、复方新诺明、多黏菌素B、诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、哌拉西林、氨苄西林、羧苄西林、丁胺卡那霉素、头孢拉定、头孢哌酮17种药物有较强抗性。

A.细菌1；B. 细菌2A.Bacterium 1; B. Bacterium 2图4 分离菌16S rRNA基因系统发育树Fig.4 Phylogenetic trees of the isolated bacteria based on 16S rRNA gene

3 讨 论

B.bronchiseptica是一种革兰阴性小杆菌，寄生在动物呼吸道黏膜上皮细胞，能引起多种动物发生呼吸道的急性或慢性炎症[8-9]。根据已有报道发现，该菌能感染猪、犬、牛、兔、鼠、猴以及刺猬、狐、粟鼠等多种野生动物[10-11]。研究表明，当支气管败血波氏杆菌感染兔后，常常导致兔发生呼吸道疾病，临床上表现出鼻炎、支气管炎和脓疱性肺炎等症状。兔多在春秋季节气候易变时发病，主要通过呼吸道感染。研究表明，感染初期，病兔出现打喷嚏的现象，随后鼻腔流出浆液性或黏液性分泌物，随着病程的延长，病兔呼吸道出现化脓或出血症状[12]。病兔剖检时部分病例可见肺部有大小不等的脓疱，有时与胸膜粘连，并伴有胸水。而另一些病例的肝上也出现黄豆大的脓疱[13]。王欣等[14]研究发现，兔群发生的以鼻腔分泌物增多、打喷嚏、食欲不振和发育不良为特征的卡他性炎症中，大部分是由B.bronchiseptica引起的。Spanoghe[15]通过对32个兔场调查发现，B.bronchiseptica的感染率为高达20%～47%。有研究报道，鼻炎和胸膜肺炎患兔中B.bronchiseptica的检出率分别高达35.8%[16]和46.0%[17]。由此可见，B.bronchiseptica仍然是兔呼吸道病的重要病原。B.bronchiseptica可单独感染家兔，也可与其他病原菌混合感染致病，而在临床上，混合感染所占的比例更大。张尤嘉和刘光远[18]以鼻孔、口角流大量黏液，呼吸急促，打喷嚏的病兔为研究对象，发现B.bronchiseptica与巴氏杆菌混合感染是造青年兔和仔兔死亡的主要原因；魏义清和李振[19]通过对患病獭兔的研究发现B.bronchiseptica与球虫是造成病免精神不振，食欲减退、鼻腔流黏性分泌物，打喷嚏的主要原因。

表3 不同药物对Brodetella bronchiseptica分离株的抑菌效果

K.pneumoniae是一种广泛分布于自然界中的人畜共患条件性致病菌，该菌主要寄生在多种动物及人的呼吸道、消化道、泌尿生殖道以及皮肤等部位。据报道，K.pneumoniae可以感染人及鼠、鸡、鸭、狐狸、熊猫、牛、羊、猪、兔等多种动物[20-25]。家兔感染K.pneumoniae，主要分为腹泻型和肺炎型两类[26]。成年兔感染K.pneumoniae后主要表现出肺炎和呼吸道及其他器官的化脓性炎症等肺炎型特征，而幼兔则主要表现出腹泻和迅速死亡等腹泻型特征[27-28]。家兔感染肺炎型较为常见，通常在气温突变时多发，且传染能力强。病兔感染K.pneumoniae后，表现出呼吸困难、打喷嚏等临床症状，剖解可见气管出血、肺部的充血和出血，化脓等病理变化[29-30]。另外，李明勇等[31]通过对规模化养兔场调查发现，仔兔感染K.pneumoniae后死亡率达15%～20%。我们课题组以往的研究显示，幼兔感染后会出现剧烈腹泻，快速死亡等特点[32]。这些报道与本研究家兔感染后发生呼吸困难、腹泻死亡的结果一致。

目前，在家兔呼吸道传染病中，兔支气管败血波氏杆菌和兔肺炎克雷伯菌病流行广泛且严重。以往的报道显示，B.bronchiseptica和K.pneumoniae都可感染各种家禽、家畜、野生动物以及水生动物，使机体受到严重损伤，但少见B.bronchiseptica与K.pneumoniae混合感染兔的报道。本研究对河南省某兔场发病兔的临床观察发现，病兔打喷嚏、呼吸困难并且伴随腹泻。病死兔剖检后的病理变化与B.bronchiseptica、K.pneumoniae感染后极其相似，难以通过临床观察和病理剖检鉴别诊断。本研究成功从疑似病兔组织中分离得到两种不同的革兰阴性菌，通过病原菌的分离培养、生化鉴定、序列分析及动物回归试验等研究发现本次分离菌株为B.bronchiseptica和K.pneumoniae。

表4 不同药物对Klebsiella pneumoniae分离株的抑菌效果

发病兔感染两种病菌后可通过呼吸道传播病菌，当带菌兔和病兔咳嗽、打喷嚏时，病菌会随咳嗽、喷嚏飞沫污染饲料、饮水、笼舍和空气，从而传染给健康兔，传染性很强。两种菌都可寄生在兔呼吸道黏膜上，当家兔受到不良因素刺激、抵抗力下降、病菌侵入机体等影响，都可能引起家兔发病。发病兔病程长，病情反复，难以彻底治愈，造成患兔生长障碍，饲料利用率低，给养兔业带来严重的经济损失[33]。家兔发病时，及时用敏感药物控制感染十分必要，但由于生产中抗生素的不当使用导致很多病原菌对药物产生耐药性，往往导致治疗效果不好。本次药敏试验显示，B.bronchiseptica和K.pneumoniae同时对庆大霉素、头孢曲松、头孢唑啉等三种药物敏感，对其他药物有不同程度的耐药性。临床上选用庆大霉素给感染病兔饮水摄入，病情很快得到控制，3 d后98%的病兔病情得到有效控制。因此当兔场发生该病时，根据药敏试验结果指导科学用药，方能获得良好的疗效。

4 结 论

从病兔组织中分离出两种革兰阴性菌，通过分离培养、生化鉴定、序列分析及动物回归试验等确定分离菌株为支气管败血波氏杆菌和肺炎克雷伯菌。经药敏试验测定发现分离得到的支气管败血波氏杆菌和肺炎克雷伯菌都对庆大霉素、头孢曲松、头孢唑啉3种药物敏感，对所检测的其他药物有不同程度的耐药性。