高效液相色谱荧光法测定血液透析器中双酚A溶出量

郭利娟，孙兴霞，刘爱娟，亓晓庆，王晨晓，沈永

(山东省医疗器械和药品包装检验研究院，国家药品监督管理局生物材料器械安全性评价重点实验室，山东省医疗器械生物学评价重点实验室，济南 250101)

随着人口老龄化，急慢性肾病的患病率在全球范围内呈逐年上升的趋势。肾衰竭已成为各国关注的疾病问题，目前临床肾脏替代疗法主要有血液透析、腹膜透析和肾脏移植［1–4］。由于肾脏移植价格昂贵，血液透析为主要的肾脏替代治疗方式［5–6］。血液透析系统主要包括血液透析机、水处理系统、血液透析器和透析液。血液透析器是血液透析系统的关键部分，又被称为“人工肾”，是血液净化的场所。血液透析器在使用过程中与人体血液及透析液均直接接触，为三类高风险器械，所以需对其进行溶出物研究，以评价血液透析器的安全有效性［7］。

血液透析器由空心纤维透析膜、壳体、密封层组成，其中壳体多为聚碳酸酯材质，空心纤维透析膜常用聚砜、聚醚砜、聚酰胺、醋酸纤维素等膜材。聚碳酸酯及聚醚砜的主要合成原料为双酚A，是一种内分泌干扰物，据研究表明塑料制品使用时释放出的双酚A被引入人体后可能会导致糖尿病、心脑血管及生殖系统等疾病［8］，从而影响身体的正常机能。基于双酚A的安全风险，中国、美国、欧盟等国家限制了其在奶瓶及食品包装材料中的应用［9］。肾衰竭患者在进行透析治疗时血液及透析液均与血液透析器直接接触，血液透析器聚碳酸酯外壳及聚砜透析膜中的双酚A单体可能会迁移至患者血液，从而给患者带来较高的风险，所以需对血液透析器中双酚A的溶出量进行研究。

目前，双酚A测定有色谱–质谱联用法、电化学分析法、免疫分析法、荧光分析法等［10–13］。Astrid Bacle等对透析器中双酚A的测定采用固相萃取–超高液相色谱–质谱联用法，操作复杂且成本较高，不易于方法的普及［14］。电化学分析法是基于溶液电化学性质的化学分析方法，选择性较差，测定时需特殊修饰的电极［15］。免疫分析方法有较高的灵敏度和选择性，但抗体制备成本较高且周期长［16］。于杰等采用高效液相色谱荧光法测定食品包装材料中双酚A的迁移量［17］。目前，高效液相色谱荧光法测定双酚A尚未应用于医疗器械领域，并且聚砜中空纤维膜中双酚A的溶出研究鲜有报道。由于样品基质较为复杂，分析测定时干扰较多，鉴于高效液相色谱荧光法具有较高的灵敏度、准确性、选择性及重复性等特点，笔者选用该方法用于聚碳酸酯及聚砜中空纤维膜中双酚A溶出量的测定，以甲醇为替代溶剂，模拟临床使用条件加严浸提血液透析器中的双酚A，采用乙腈和醋酸铵缓冲盐为流动相，通过优化浸提条件及色谱条件等相关因素，建立灵敏、高效、准确的测定方法，可用于评估血液透析器中双酚A溶出量，为该类产品安全性风险评估提供数据支持，为监管部门提供技术支持。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：1260型，配荧光检测器，美国安捷伦科技有限公司。

滚压泵：JHBP–2000型，广州市暨华医疗器械有限公司。

pH计：Seven Excellence型，梅特勒–托利多控股有限公司。

数显电子恒温水浴锅：HH–8型，常州国华电器有限公司。

超纯水系统：Milli-Q A10型，美国密理博公司。

旋转蒸发仪：RV10control型，德国IKA集团。

数控超声波清洗器：KQ3200DE型，昆山市超声仪器有限公司。

控制型控温摇床：KS 4000i control，德国IKA集团。

双酚A对照品：纯度为99.8%，编号为30074，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

甲醇、乙腈：色谱纯，德国默克公司。

醋酸、醋酸铵：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

实验用水为超纯水。

1.2 溶液配制

双酚A系列标准工作溶液：精密称取双酚A对照品10.62 mg于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解、稀释、定容，得质量浓度为102.4 μg／mL的标准储备液，采用逐级稀释法分别配制质量浓度为51.2、102.4、204.8、409.6、1 024 ng／mL的双酚A系列标准工作溶液。

醋酸铵缓冲溶液：精密称取1.54 g醋酸铵于1 L容量瓶中，用水溶解、稀释、定容，用醋酸调节pH至4.0。

1.3 色谱条件

色谱柱：Waters BEH Shield RP18型色谱柱［150 mm×4.6 mm，3.5 μm，沃特世科技（上海）有限公司］；激发波长：232 nm ；发射波长：314 nm；柱温：30 ℃；进样体积：10 μL；流动相：A相为乙腈；B相为醋酸铵缓冲溶液，梯度洗脱条件列于表1。

表1 梯度洗脱条件

1.4 样品预处理

参照血液透析器临床使用说明，按图1所示连接血液透析器及硅胶管路，分别形成2个独立的循环系统，在玻璃烧杯中各加入1 000 mL超纯水，通过滚压泵注满整个闭路系统，以200 mL／min的流量分别冲洗血液透析器血液侧与透析液侧，冲洗完毕后吹入氮气去除血液透析器中的液体。按图2所示连接血液透析器及硅胶管路形成闭合循环系统，溶剂瓶中加入500 mL甲醇，通过滚压泵在（37±1）℃下以200 mL／min的流量循环5 h，循环完毕后将硅胶管路及血液透析器中浸提液转移至溶剂瓶，溶剂瓶中加入甲醇至溶液体积为600 mL，即得样品浸提液。取500 mL甲醇于溶剂瓶，使用硅胶管形成闭合循环回路，通过滚压泵在（37±1）℃下以200 mL／min的流量循环5 h，将循环管路中甲醇转移至溶剂瓶，溶剂瓶中加入甲醇至溶液体积为600 mL，即得得空白对照液。分别量取空白对照液和样品浸提液100 mL旋蒸至干，精密移取2.0 mL甲醇至旋蒸瓶，涡旋至残渣完全溶解，用0.45 μm滤膜过滤，得空白供试液和样品供试液。

图1 血液透析器预冲洗示意图

图2 血液透析器双酚A浸提示意图

2 结果与讨论

2.1 浸提溶剂的选择

双酚A易溶于甲醇、乙醇、丙酮、苯等有机溶剂，难溶于水。样品于37 ℃循环浸提，甲醇、丙酮的沸点低于乙醇、苯（毒性较大），有利于样品浸提液浓缩处理；丙酮沸点虽较甲醇低，但样品不耐受丙酮。因此选择甲醇作为替代溶剂模拟临床使用对双酚A进行加严浸提。

2.2 检测波长的优化

采用高效液相色谱荧光法对双酚A标准溶液的激发波长（210～300 nm）及发射波长（280～400 nm）进行光谱扫描。结果表明，双酚A的最佳激发波长和发射波长分别为232、314 nm。

2.3 样品预处理方式的选择

取血液透析器端盖及外壳部分剪成小块样品，以甲醇为浸提溶剂，按照1 g样品–10 mL甲醇的比例浸提，分别采用超声和振荡两种方式浸提。采用甲醇对样品进行10、20、30 min超声浸提，分别超声浸提3次，试验结果表明三次超声浸提均未达到极限浸提。另将样品于控制型控温摇床振荡（37 ℃，200 r／min）浸提5、24 h，测得浸提液中双酚A的浓度分别为8.58、27.58 ng／mL，说明双酚A的溶出量随浸提时间的增加而增加。

通过上述试验表明超声浸提及振荡浸提时样品中双酚A均不能达到极限浸提，无法准确测定样品中双酚A的残留量，故采用模拟临床使用的方式进行样品预处理。

2.4 专属性试验

分别取空白供试液、双酚A对照品溶液及样品供试液，按照1.3色谱条件进行测定。试验结果表明，双酚A对照品的保留时间约为21.5 min，样品供试液中双酚A的保留时间与双酚A对照品的保留时间基本一致。双酚A的色谱峰峰形良好且与邻近色谱峰分离度均大于1.5，空白供试液及样品供试液对本实验分析均无干扰，满足试验要求，方法专属性良好。双酚A对照品溶液色谱图见图3

图3 双酚A对照品溶液色谱图

2.5 线性方程、检出限与定量限

按照1.3色谱条件测定1.2配制的双酚A系列标准工作溶液，以双酚A的质量浓度（x，ng／mL）为横坐标，以色谱峰面积（y）为纵坐标，绘制标准工作曲线。计算得到双酚A在质量浓度为51.2～1024 ng／mL范围内与色谱峰面积线性关系良好，线性回归方程为y=0.065 2x–0.794 2，线性相关系数为0.999 9。

用甲醇稀释1.2配制的双酚A标准储备液并进行测定，以3倍的信噪比（S／N）计算检出限，10倍的S／N计算定量限，得到该方法下双酚A的检出限与定量限分别为10.8、51.2 ng／mL。

2.6 加标回收与精密度试验

在样品浸提液基质中分别添加低、中、高浓度的双酚A标准溶液，精密量取样品加标浸提液100 mL旋蒸至干，精密移取2.0 mL甲醇至旋蒸瓶，涡旋至残渣完全溶解，用0.45 μm滤膜过滤，得样品加标供试液。3个加标水平分别为51.50、103.0、206.0 ng／mL，每个加标水平平行测定6次，结果见表2。由表2可知，双酚A在3个浓度水平的平均加标回收率为90.23%～104.21%，相对标准偏差为0.831 8%～3.661%，表明该方法的准确度及精密度良好，均符合《中国药典》2020版9101分析方法验证指导原则中的指标要求［18］。

表2 加标回收试验结果

2.7 样品测定

采用本方法对血液透析器平行测定三组，将测定结果代入式(1)，计算其临床接触量，结果见表3。

表3 血液透析器中双酚A临床接触量测定结果

式中：W——每套样品中双酚A临床接触量，μg；

c——样品供试液中双酚A质量浓度，ng／mL。

由表3结果可知，每套血液透析产品中双酚A的最大临床接触量为1.386 μg。根据GB／T 16886.17—2005 《医疗器械生物学评价 第17部分：可沥滤物允许限量的建立》对血液透析器中双酚A允许限量进行评估，本方法对血液透析器中双酚A的测定值在允许限量范围内［19］。

3 结语

建立了血液透析器中双酚A的浸提方法，采用高效液相色谱荧光法测定血液透析器中双酚A的溶出量。该方法专属性强、灵敏度高、精密度及准确度好，可用于血液透析器安全性风险评估，为监管部门提供技术支持。