多发性骨髓瘤患者骨髓细胞周期素D1、D3、p21的表达及与预后的相关性研究*

杨 彦 潘志兰 张志敏

多发性骨髓瘤是临床上一种难治性恶性肿瘤，该疾病主要是由于骨髓克隆性浆细胞恶性增生同时单克隆免疫球蛋白增加所致[1,2]，是血液系统中第三大恶性肿瘤，其发病率在血液系统恶性疾病中仅次于淋巴瘤，常见于老年人，具有发病率高、预后差、死亡率高等特点。多发性骨髓瘤的主要临床特征为骨痛、骨损害、贫血、反复感染等[3，4]。患者早期缺乏特异性临床表现，不易发现，多数患者就诊时病情较严重，对治疗及预后造成严重影响。目前，对多发性骨髓瘤的研究以探究其发病机制、提高治疗效果、改善患者预后为主[5]。随着研究的不断深入及医疗科技水平的不断提高，免疫抑制剂、蛋白酶抑制剂、自体干细胞移植等的应用治疗多发性骨髓瘤，大大改善了患者预后，使患者的中位生存时间从3年增加到6年左右，但患者仍会复发，如何治愈多发性骨髓瘤仍是医学者需要克服的重要难题，寻找该疾病的发生发展的相关机制，并探究其与患者预后的关系已成为目前临床研究的重点领域。

细胞周期素D1(Cyclin D1)和细胞周期素D3(Cyclin D3)是细胞周期素G家族的重要成员，在促进细胞增殖、加速细胞周期转变等过程具有重要作用[6，7]。p21是细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子，相关研究显示p21的异常表达可影响细胞的增殖、分化及肿瘤的发生[8]。有研究显示，Cyclin D1、D3、p21与多发性骨髓瘤的发生密切相关。基于此，本研究拟通过检测多发性骨髓瘤患者骨髓中Cyclin D1、D3、p21的表达情况及与预后的关系，为临床治疗多发性骨髓瘤提供有价值的参考依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象和分组

选取2015-07—2016-12本院收治的多发性骨髓瘤患者80例为多发性骨髓瘤组，其中，男性46例，女性34例，年龄49-68岁。同期选取在本院就诊患有营养性贫血者20例为对照组，其中，男14例，女6例，年龄48-68岁。多发性骨髓瘤组与贫血对照组间性别、年龄等比较，差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经本院道德伦理委员会批准通过(批号：20140725)，所有样品采集均取得患者及家属知情并签署同意书，且符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。

1.2 纳入排除标准

多发性骨髓瘤组纳入标准：(1)符合2013年制定的《中国多发性骨髓瘤诊治指南》中有关多发性骨髓瘤的相关诊断标准[9]；(2)患者及家属选择在本院接受治疗者；(3)入院前未进行放化疗治疗者；(4)自愿加入本研究者；(5)临床资料完整者。排除标准：(1)患有系统性疾病者；(2)患有其它恶性肿瘤及癌症者；(3)患有严重内分泌疾病者；(4)严重精神疾病不配合治疗者。

1.3 主要试剂与仪器

总RNA提取试剂盒(货号：RM102)购自于兰州美伯生物医药科技有限公司；逆转录试剂盒(货号：KL266)购自于上海康朗生物科技有限公司；各引物由北京甘棠飞华生物科技有限公司设计合成；本研究中其它化学药品均购自上海吉玛制药技术有限公司。离心机(型号：JIDI-21D)购自于广州吉迪仪器有限公司；实时荧光定量PCR仪(货号：V115896)购于美国Applied Biosystems公司。

1.4 观察指标与方法

1.4.1 样品采集及处理：在无菌条件下对所有受试者进行骨髓液(5ml)采集，然后肝素抗凝，离心后收集骨髓单个核细胞，置于-70℃冰箱中保存待测。

1.4.2 骨髓中Cyclin D1 mRNA、Cyclin D3 mRNA、p21 mRNA表达水平检测：采用实时荧光定量PCR法(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)检测各组研究对象骨髓中Cyclin D1、Cyclin D3、p21 mRNA表达水平。扩增体系为10μl，反应条件：95℃预变性3min，95℃15s，65℃1min，70℃延伸40s，行35个循环。各引物序列见表1。采用2-△△Ct法计算骨髓中Cyclin D1、Cyclin D3、p21 mRNA相对表达量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4.3 免疫组化染色：采用免疫组化法检测各组骨髓单个核细胞Cyclin D1、Cyclin D3、p21蛋白阳性表达情况。染色结束后随机取10个高倍镜视野进行病理切片观察，并统计阳性细胞数量，阳性细胞比例分成5个等级：无阳性细胞，0分；1%-24%，1分；25%-49%，2分；50%-74%，3分；75%-100%，4分。染色强度判断：无染色为0分；浅黄色，1分；棕黄色，2分；棕褐色，3分。两项得分相乘：0-6分为阴性，6分以上为阳性。

1.5 随访

对本研究中涉及到的所有多发性骨髓瘤患者治疗出院后进行为期3年的门诊复查或电话随访，末次随访时间为2019-12-30，死亡患者以死亡时间作为随访截止期，并做好记录，本次研究中未出现失访病例。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 两组骨髓中Cyclin D1、D3、p21 mRNA表达水平比较

多发性骨髓瘤组Cyclin D1、D3 mRNA表达水平均显著高于对照组(P<0.01)；p21 mRNA表达水平显著低于对照组(P<0.01)。详见表2。

表2 两组骨髓中Cyclin D1、D3、p21mRNA表达水平比较

2.2 两组骨髓中Cyclin D1、D3、p21蛋白阳性表达率比较

多发性骨髓瘤组Cyclin D1、D3阳性表达率均显著高于对照组(P<0.01)；p21阳性表达率显著低于对照组(P<0.01)。见表3。

表3 两组骨髓Cyclin D1、D3、p21蛋白阳性率比较

2.3 骨髓中Cyclin D1、D3、p21表达与患者预后的关系

本次80例多发性骨髓瘤患者随访时间3年，生存41例，总生存率51.2%。以Cyclin D1、D3、p21 mRNA各自表达水平的平均值(1.57、0.66、1.29)分别将多发性骨髓瘤患者分为高表达组(高于平均值)和低表达组(低于平均值)。绘制多发性骨髓瘤患者治疗后1—36个月高、低表达组的生存曲线。Cyclin D1高表达组术后3年总生存率低于Cyclin D1低表达组(χ2=5.031，P<0.05)；Cyclin D3高表达组术后3年总生存率低于Cyclin D3低表达组(χ2=7.336，P<0.05)；p21高表达组术后3年总生存率高于p21低表达组(χ2=11.361，P<0.01)。见图1、2、3和表4。

表4 不同Cyclin D1、D3、p21表达水平患者生存率比较

图1 不同水平Cyclin D1多发性骨髓瘤患者3年生存曲线分析

2.4 影响多发性骨髓瘤患者预后的因素分析

单因素分析显示，Cyclin D1、D3、p21表达水平是影响多发性骨髓瘤患者预后的危险因素。多因素分析显示，Cyclin D1、D3高表达和p21低表达是影响多发性骨髓瘤患者预后的独立危险因素(HR=2.884，95%CI为1.714-4.853；HR=2.575，95%CI为1.266-5.239；HR=2.979，95%CI为1.671-5.312；P均<0.05)。详见表5。

图2 不同水平Cyclin D3多发性骨髓瘤患者3年生存曲线分析

图3 不同水平p21多发性骨髓瘤患者3年生存曲线分析

表5 影响多发性骨髓瘤患者预后的因素分析

3 讨 论

Cyclin D是细胞周期的正性调控因子，其可通过激活相关酶的活性改变细胞周期[10]。Cyclin D1、D3是Cyclin D的两个重要成员，在参与DNA合成、促进细胞周期转变及导致细胞癌变中发挥重要作用[11]。任婧婧等[12]研究发现，可通过RNA干扰Cyclin D1蛋白表达来诱导多发性骨髓瘤细胞的凋亡。王卓[13]研究发现，Cyclin D3可作为曲妥珠单抗治疗乳腺癌的有效蛋白标记物。Rasmussen等[14]研究发现，在42%(46/110)的多发性骨髓瘤样本中检测到Cyclin D1，且Cyclin D1 mRNA在多发性骨髓瘤患者中呈高表达。本研究结果显示，多发性骨髓瘤组Cyclin D1、D3 mRNA表达水平及蛋白阳性率显著高于对照组，提示Cyclin D1、D3可能通过促进细胞周期转化，进而参与多发性骨髓瘤的发生发展。

p21是一种细胞周期负调控蛋白，位于P53基因下游第6号染色体上，相对分子质量为21 kDa[15]。大量研究已证实，p21与多种肿瘤的发生发展密切相关。张军等[16]研究发现，p21在卵巢浆液性腺癌患者中表达降低，且其表达水平与患者预后密切相关。Yao等[17]研究发现，组蛋白脱乙酰激酶抑制剂可通过靶向p21基因，促进p21表达上调，从而诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡。Dhyani等[18]研究发现，ANKHD1可通过下调p21启动子的活性，进而促进多发性骨髓瘤细胞的生长。本研究结果发现，多发性骨髓瘤组p21 mRNA表达水平及蛋白阳性率显著低于对照组，提示p21可能受ANKHD1抑制，进而导致多发性骨髓瘤的发生发展。生存曲线分析表明，Cyclin D1、D3高表达组术后3年总生存率低于Cyclin D1、D3低表达组，p21高表达组术后3年总生存率高于p21低表达组，提示Cyclin D1、D3、p21表达水平可为多发性骨髓瘤患者预后的预测提供参考。Cox多因素分析显示，Cyclin D1、D3高表达和p21低表达是影响多发性骨髓瘤患者预后的独立危险因素，提示降低Cyclin D1、D3表达和升高p21表达可能有助于缓解多发性骨髓瘤病情的发展，有利于患者预后。

综上所述，Cyclin D1、D3在多发性骨髓瘤患者中的表达明显升高，p21的表达水平降低，三者水平均与患者预后密切相关，提示Cyclin D1、D3、p21可能作为多发性骨髓瘤的病情评估及不良预后预测的的潜在生物学指标。

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