基于入血成分和网络药理学研究桂枝茯苓胶囊抗乳腺增生症的作用机制

朱晓芹,裴志斐,严石焕,覃 杨,蓝慧琴,王博龙,朱 丹*

(1.宜春学院化学与生物工程学院,江西 宜春 336000;2.宜春市第二人民医院,江西 宜春 336000;3.广西医科大学药学院,南宁 530021)

桂枝茯苓丸出自东汉医圣张仲景的《金匮要略》一书,由桂枝、茯苓、芍药(白芍)、牡丹皮、桃仁组成,是活血化瘀消癥的经典名方。桂枝茯苓胶囊是其现代制剂,具有抗炎、镇痛、抗肿瘤、调节平滑肌、调节内分泌等药理作用,在临床上广泛应用于乳腺增生症、原发性痛经、子宫肌瘤、盆腔炎、多囊卵巢综合征等妇科疾病治疗[1]。临床及实验研究发现其治疗乳腺增生症的疗效优于乳宁片[2]、乳癖消片[3]、小金丸[4]等,且毒副作用小,具有较高的应用价值。由于桂枝茯苓胶囊是多成分、多靶点的复方中药,其治疗乳腺增生症的药效物质及分子机理尚不明确。

网络药理学可挖掘数据库的海量资源,全面研究复方中药的药效物质及作用机理。然而,大多数网络药理学研究,主要根据OB、DL等参数来筛选复方中药的药效物质。而血清药物化学认为口服药物的药效物质必须进入血液循环才能发挥药理作用,故以入血成分作为药效物质进行网络药理学研究将会更加客观、严谨。尹权微等[5]通过血清药物化学研究发现了芍药内酯苷、芍药苷、苦杏仁苷(代谢产物为野樱苷)、没食子酸、没食子酸乙酯等12种桂枝茯苓胶囊入血成分,为其药理研究奠定了物质基础。本研究基于桂枝茯苓胶囊12种入血成分,通过网络药理学挖掘它们抗乳腺增生症的作用靶点、生物过程及信号通路,进而揭示其作用机理。

1 材料和方法

1.1 入血成分抗乳腺增生症靶点预测

在PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)网站下载桂枝茯苓胶囊12种入血成分的3D结构,运用ChemBioOffice 2014软件对3D结构进行MM2能量最小化并保存为mol2格式,通过PharmMapper服 务 器 在 Targetbank、Drugbank、Binding DB、PDTD数据库中自动匹配潜在靶蛋白。最后运用UniProt数据库统一上述靶蛋白。再在GeneCards、PubMed、GenCLip 3数据库中,检索"hyperplasia of mammary glands"以挖掘乳腺增生症靶点。最后将入血成分靶点与乳腺增生症靶点输入Draw Venn Diagram(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)网站,定义重合靶点为桂枝茯苓胶囊治疗乳腺增生症的靶点。

1.2 入血成分-靶点网络构建

利用Cytoscape软件构建12种入血成分及其抗乳腺增生症靶点网络,以节点度(degree)表示入血成分作用的靶点个数,分析桂枝茯苓胶囊入血成分、抗乳腺增生症靶点的内在关联。

1.3 蛋白互作网络构建及关键靶点的筛选

将桂枝茯苓胶囊抗乳腺增生症的入血成分及对应靶点导入STRING(https://string-db.org/),设置物种为"Homo sapiens",最低相互作用阈值为0.4,其他参数保持默认值,以构建蛋白互作网络(protein-protein interaction,PPI)。

再利用CytoNCA插件计算PPI网络的自由度中心性(degree centrality,DC)、介度中心性(betweenness centrality,BC)、接近中心性(closeness centrality,CC)、特征向量中心性(eigenvector centrality,EC)、网络中心性(network centrality,NC)和局部边连通性(local average connectivity,LAC)等参数。筛选标准:①DC值大于所有节点DC值中位数2倍;②其他5个参数均大于所有节点中位数,即得到关键靶点。

1.4 关键靶点的GO生物过程分析

利用Cytoscape软件中"ClueGO"插件进行关键靶点的GO富集分析,分析条件为Min Lever=3,Max Lever=8;Number of Genes=3,Min Percentage=4.0;Kappa Score=0.4;其余选项选择默认。

1.5 关键靶点的KEGG通路分析

利用DAVID数据库进行关键靶点KEGG富集分析,物种与背景设置均为"Homo sapiens";并通过Omicshare软件(http://www.omicshare.com/tools/index.php/)对富集结果进行可视化展示。

2 结果

2.1 入血成分抗乳腺增生症靶点筛选

表1为12种入血成分的基本信息。通过PharmMapper服务器分别得到287、287、291、289、53、171、289、244、92、289、282、289个靶点,合并去重后确定了入血成分的421个靶点。从GeneCards、PubMed、GenCLip 3数据库检索得到乳腺增生症靶点2005个,映射得到入血成分抗乳腺增生症靶点197个,并以此作为桂枝茯苓胶囊治疗乳腺增生症的靶点。

表1 入血成分反向对接基本信息Table 1 Basic information of reverse molecular docking of constituents migrating to blood

2.2 入血成分-乳腺增生症靶点网络的构建

图1是桂枝茯苓胶囊入血成分及其抗乳腺增生症靶点网络,中间的12个六边形节点代表入血成分,外周197个圆形节点为抗乳腺增生症靶点,1468条连线表示入血成分对靶点的作用,由图可见桂枝茯苓胶囊能够多成分、多靶点治疗乳腺增生症。

图1 桂枝茯苓胶囊入血成分-靶点网络Figure 1 Constituents migrating to blood-targets network of Guizhi Fuling Capsule

2.3 蛋白互作网络分析

图2为蛋白互作网络,其包括197个节点(所有靶蛋白均参与)和2580条连线。采用CytoNCA插件分析网络节点的拓扑属性,进而获得31个关键靶点,见图3、表2。31个关键靶点包括转录及凋亡蛋 白AKT1、MAPK1、CASP3、MAPK8、BCL2L1、MDM2、STAT1;信 号 传 导 蛋 白 SRC、HRAS、HSP90AA1、MAPK14、PIK3R1、MAP2K1、PTPN11;

表2 关键靶点及其拓扑参数Table 2 Key targets and their topological parameters

图2 桂枝茯苓胶囊靶蛋白PPI网络Figure 2 PPI network of target protein of Guizhi Fuling Capsule

图3 关键靶点的筛选策略图Figure 3 Screening strategy for key targets

血管生成相关靶点EGFR、MMP2、KDR、NOS3;激素相关受体IGF1、ESR1、AR、IGF1R;炎症因子IL2;氧化还原酶CAT和其他,说明桂枝茯苓胶囊可能是通过调节以上受体、酶、转录凋亡蛋白、信号传导蛋白、炎症因子,发挥治疗乳腺增生症的作用。

2.4 GO生物过程富集分析

如图4所示,关键靶点的GO生物过程富集分析得到142条信息,主要为肌醇脂质介导的信号转导、乳腺上皮细胞发育、细胞对活性氧的反应、蛋白质在细胞外周定位的调控、ERBB信号通路、磷脂酰肌醇信号、一氧化氮合酶生物合成过程的正调控、T细胞共刺激、血管内皮生长因子受体信号通路,共计14大类,说明桂枝茯苓胶囊治疗乳腺增生症可能与乳腺细胞增生、氧化反应、细胞免疫、血管生成等生物过程有关。

图4 GO生物过程注释饼状图Figure 4 Pie diagram of GO biological process

2.5 KEGG通路分析

如图5所示,根据P＜0.01,筛得与乳腺增生症发生、发展密切相关的信号通路共15条,分别为激素相关的雌激素信号通路、催乳素信号通路、促性腺激素释放激素信号通路、甲状腺激素信号通路;血管生成相关的VEGF信号通路、低氧诱导因子-1信号通路;免疫相关的T细胞受体信号通路、趋化因子信号通路;炎症相关的TNF信号通路、MAPK信号通路;细胞凋亡相关的凋亡通路、PI3K-Akt信号通路。其中富集因子(richfactor)最大的是催乳素信号通路,富集靶点数最多的是PI3K-Akt信号通路。

图5 KEGG信号通路富集分析Figure 5 Enrichment analysis of KEGG signaling pathway

3 讨论

乳腺增生症是最为常见的女性乳腺疾病,好发于25~45岁中青年女性,临床以疼痛和肿块为主要症状。现代医学认为体内雌、孕激素分泌失调及雌激素持续刺激,导致乳腺组织增生而又复旧不全,是乳腺增生症发病的主要原因[6-7]。临床治疗以抗雌激素药物为主,但此类药物存在月经紊乱、闭经等多种不良反应[8-9]。

本研究利用网络药理学方法,明确了桂枝茯苓胶囊12种入血成分治疗乳腺增生症的197个靶点,依据PPI网络中的6个重要拓扑参数,筛选出31个关键靶点,并富集这些关键靶点的GO生物过程及KEGG通路。其中激素方面的关键靶点有雌激素受体α(ESR1)、雄激素受体(AR)、胰岛素样生长因子1型受体(IGF1R)及其配体IGF1;相关的KEGG通路有雌激素信号通路、催乳素信号通路、促性腺激素释放激素(GnRH)信号通路等,且催乳素信号通路是所有通路中富集因子最大的。生理情况下,雌激素调控乳管及管周组织生长;乳腺小叶及腺泡组织发育为孕激素调节;而催乳素则发挥协同作用。

乳腺组织在各激素的共同作用下发生周期性变化。当下丘脑-垂体-卵巢内分泌轴失衡,患者体内雌激素分泌增多,而孕激素分泌不足;同时患者体内泌乳素水平升高,其不仅直接刺激乳腺组织,还可抑制黄体期孕酮的分泌,促进雌二醇的合成,从而导致雌孕激素比例失调,在雌激素持续刺激下最终造成乳腺增生症[10]。而动物及人体研究均已证实桂枝茯苓胶囊不仅能够降低乳腺增生大鼠的雌激素,升高其孕激素,进而抑制乳腺增生,还可有效调节性激素水平,降低多发乳腺纤维瘤患者的术后复发率[11-12]。以上结果说明,不同于西药抗雌激素药物的单纯拮抗,桂枝茯苓胶囊主要影响多种性激素的水平或者它们与其受体的作用,通过纠正下丘脑-垂体-卵巢内分泌轴的失衡而抗乳腺增生症。

近年研究还认为乳腺增生症的发生、加重、甚至癌变的过程,就是乳腺上皮细胞增殖过度以及凋亡减弱的结果[13]。我们的预测分析显示,桂枝茯苓胶囊抗乳腺增生症的关键靶点中就包含AKT1、CASP3、BCL2L1、MAPK1、MAPK8、STAT1等多个重要的凋亡调控蛋白,涉及的通路有凋亡通路、PI3KAkt信号通路等,且多数关键靶点富集在PI3K-Akt信号通路。明松林等[14]的实验证实桂枝茯苓汤可以降低Bcl-2蛋白的表达,促进Bax、Caspase-3/9以及Bid蛋白的表达,诱导乳腺癌细胞凋亡。吴代陆等[15]则发现PI3K-Akt通路与乳腺增生症的发生发展密切相关,其激活后会直接磷酸化下游的mTOR,产生抗凋亡效应,促进乳腺细胞增殖;而阻断该通路则可促进乳腺细胞凋亡,发挥抑制乳腺增生的作用。还有研究表明,胰岛素生长因子1(IGF1)、表皮生长因子(EGF)和性激素可通过mTOR通路调节乳腺上皮细胞的自噬,使乳腺上皮细胞的增殖与凋亡达到动态平衡,而本文桂枝茯苓胶囊抗乳腺增生症的关键靶点就含有IGF1,以及EGF与性激素的受体[16]。由此可见,调控凋亡相关蛋白及通路,促进乳腺细胞凋亡是桂枝茯苓胶囊抗乳腺增生症的另一主要机理。

此外,增生的乳腺组织常伴有新生血管、氧自由基增多,新生血管越丰富,乳腺增生就越严重;而过多的氧自由基使得生物膜上的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应,可促进炎症细胞因子释放,导致乳腺细胞损伤、增生甚至癌变等[17-19]。我们预测的桂枝茯苓胶囊抗乳腺增生症关键靶点还包括血管生成相关的EGFR、MMP2、KDR、NOS3;以及炎症因子IL2、氧化还原酶CAT等,涉及VEGF、HIF-1、TNF等信号通路,与乳腺上皮细胞发育、细胞对活性氧的反应、一氧化氮合酶生物合成过程的正调控、T细胞共刺激等生物过程相呼应。张珍珍等[20]发现桂枝茯苓胶囊可抑制炎性反应及细胞因子合成。肖新春等[21]则证实桂枝茯苓胶囊可降低VEGF表达,抑制血管增生。所以,除了调节性激素平衡,促进乳腺细胞凋亡外,桂枝茯苓胶囊治疗乳腺增生症机制还可能与抗炎、抗氧化、抗血管生成有关。

总之,本研究基于桂枝茯苓胶囊的入血成分,通过网络药理学方法预测了其抗乳腺增生症的作用靶点、生物过程、信号通路,为实验验证桂枝茯苓胶囊治疗乳腺增生症的药理机制指明了方向。