实验中丙烯酰胺控制损失关键点及方法优化

李金莉 周冰谷

广东省广州市精益和泰质量检测股份有限公司 广东广州 510000

随着生活的丰富与多元化使得人们开始重视食品的营养与质量安全，食品的热加工过程中产生的一系列物化反应与改变食品组分的结构和功能的同时也会产生一些不可忽视的有害物质（如杂酰胺、丙烯酰胺）[1]。因此，在这里对丙烯酰胺的实验过程进行了优化及改进实验方案。

1 实验过程的损失排查过程

1.1 样品液上机液相色谱-串联质谱

GB5009.204-2014方法，由于做过程曲线的丙烯酰胺上机后内标及目标物几乎无响应，所以需要排查原因，从人、物资、材料、方法、环境中分析，其它因素都相对稳定，因此考虑优先从实验方法着手分析无响应的原因[2]。

1.2 实验损失排查（逐步排查法）

为了避免塑料制品中途带入污染物，我们试验过程全程选用玻璃制品。

1.2.1 样品制备（从第一步骤起考察目标物流失）

根据GB5009.204-2014方法步骤，（玻璃器皿使用三角瓶或玻璃离心管）称取1.00g样及空白加标，j加入超纯水10ml，均质后加入1mg/L13C3-丙烯酰胺400μL（最终20ppb内标，相当于每克样加入内标20ng）→振荡混匀30min，离心（10min,4000rpm），用一次性枪头吸取上清液200μL上机。→k净化：（固相萃取柱净化）向上清液加入5ml正己烷，振荡萃取10min，离心，除去有机相，取200μL水相上机→l取5ml滤液过HLB小柱，收集流出液→m过BondElut-Accucat小柱，取200μL上机→n氮吹、0.1%甲酸溶液复溶、上机。

上机分析，步骤j样品、空白加标内标响应均很低，因此考虑步骤j提取失败，考虑更换提取试剂。

1.2.2 样品制备方案改进（从第一步骤起考察目标物流失）

j改加10ml5mol/LNaCl溶液提取液上机后分析内标响应更高，因此5mol/LNaCl溶液更适合做提取试剂。l过HLB小柱后的内标响应基本丢失，因此HLB小柱是除杂效果；mn内标响应回升，但仍然比过小柱前响应弱很多。因此，尽管这个方法优化提取试剂外，固相萃取净化依然损失较大，为了得到更加理想的目标响应，减少过程损失，决定继续优化为弃除小柱，直接提取上机。

1.3 实验再优化提升响应值

尽管过柱改良，但依然损失大，考虑使用不过柱方法，直接去除过柱的损失。称取样品0.5g，加内标100μL（1mg/L内标），涡旋30秒→加0.3ml0.02mol/L的醋酸铵（确保样品完全溶解），涡旋30秒→再加4.7ml乙腈，涡旋60秒、10000r离心10分钟→取2ml上清液，氮吹，复溶1ml（内标20ppb）→跑样采用双柱超高效液相色谱柱。

1.4 标准溶液的配置

（1）丙烯酰胺标准储备溶液（10mg/L）：准确移取浓度液体标准品丙烯酰胺（100mg/L）1mL，加甲醇稀释至10mL，置-20℃冰箱中保存。

（2）13C3-丙烯酰胺内标标准储备溶液（10mg/L）：准确移取浓度100mg/L液体标准品13C3-丙烯酰胺内标1mL，加甲醇稀释至10mL，置-20℃冰箱中保存。

（3）标准曲线工作溶液。丙烯酰胺标准工作溶液II（1.0mg/L）：确移取浓度1.0ml丙烯酰胺工作液（10mg/L）与内标工作溶液（10mg/L）0.02mL，用0.1%甲酸水稀释至刻度10mL，内标浓度为100μg/L,临用时配置。

13C3-丙烯酰胺内标标准工作溶液II（0.1mg/L）：确移取13C3-丙烯酰胺内标（10mg/L）0.02mL，用0.1%甲酸水稀释至刻度10mL,临用时配置。

分别移取0，1,5,10,20,50,100μL丙烯酰胺工作液II（1.0mg/L）,并用13C3-丙烯酰胺内标工作溶液II（0.02mg/L）定容1.0mL。

1.5 仪器参考条件

（1）色谱条件：

色谱柱：2根串联×watersC18（100×2.1mmI.D.1.7μm)。

预柱：C18保护柱（5μm、2.1mmI.D.×30mm）或等效柱。

流动相：0.1%甲酸5mM乙酸铵溶液/甲醇/乙腈（95:3:2，体积分数）。

流速：0.2ml/min。

进样体积：10μL。

柱温：35℃。

（2）质谱参数（三重四极串联质谱仪）参数见下表1。

表1 质谱参数

2 结语

本文经过试验检验GB5009.204-2014方法测定油炸、烘烤食品中的丙烯酰胺，首先，对丙烯酰胺的提取条件进行单因素的逐步优化，包括提取试剂、小柱除杂、小柱吸收等，而关键步骤在于提取溶剂的挑选，最后把水更换为加10ml5mol/LNaCl溶液提取效果更佳，实验效果更好[3]。而最后优化实验，把提取溶剂换成0.02mol/L的醋酸铵提取转换溶剂后直接上机，色谱响应高，最低浓度能做到1ng/ml,比标准方法的浓度还低，信噪比高，对杂质多的样品分离效果特别好，从而获得更优的实验结果。