冻融卵裂期优质胚胎发育速度对临床妊娠结局的影响

张晓磊，王明磊，李甲楠，卢美松

(哈尔滨医科大学附属第一医院生殖医学科，哈尔滨 150001)

随着体外受精-胚胎移植(IVF-ET)技术的发展，为了增加患者的累积妊娠率，冻融胚胎移植(FET)技术受到越来越多的关注[1]。冻融胚胎的发育潜能是影响FET妊娠结局的重要因素，而观察冻融胚胎复苏后的继续生长情况是判定胚胎发育潜能的常用方法[2]。新鲜周期卵裂期优质胚胎较非优质胚胎有更好的发育潜能及妊娠结局，本研究回顾性分析我生殖中心冻融卵裂期优质胚胎过夜培养后卵裂球翻倍增殖情况与临床结局的关系，以探讨冻融卵裂期优质胚胎发育潜能对FET周期临床妊娠结局的影响。

资料与方法

一、研究对象

选择2016年1月至2020年1月在本中心因新鲜周期未移植及新鲜周期移植妊娠失败行FET的患者为研究对象，共纳入1 723个周期。纳入标准：盆腔输卵管因素不孕；排卵障碍性不孕；不明原因不孕；男性因素不孕。排除标准：反复种植失败；子宫内膜异位症；薄型子宫内膜(<7 mm)等。

二、研究方法

1.胚胎冷冻：胚胎冷冻选择的冷冻液为VitrificationVT101(KITAZATO，日本加藤)，由平衡液(equilibration solution)和玻璃化液(vitrification solution)2种液体组成。首先将胚胎置于平衡液中8～10 min，平衡结束后再放置于玻璃化液表面来回吹洗数次，并在1 min内将胚胎滴到冷冻载杆尖端位置，确认胚胎在载杆尖端上后，快速放入液氮中并套上套管进行保存。根据取卵后第3天(D3)胚胎形态和碎片多少评价胚胎质量，将胚胎分为4级：Ⅰ级，碎片<5%；Ⅱ级，5%≤碎片<20%；Ⅲ级，20%≤碎片<50%；Ⅳ级，碎片≥50%。卵裂球数目≥6的Ⅰ级、Ⅱ级胚胎作为优质胚胎进行冷冻。

2.胚胎复苏：胚胎解冻选择的解冻液为VitrificationVT102(KITAZATO，日本加藤)。首先在液氮中将载杆套管取掉后拿出，迅速放于室温下解冻液(TS)中反复洗涤1 min，然后迅速将胚胎转移至稀释液(DS)中平衡5 min，迅速转移至洗涤液1(WS1)中3 min，再至洗涤液2(WS2)中3 min，最后移入预先在37℃、5%CO2培养箱内平衡好的胚胎培养液中培养，并等待移植。

3.内膜准备与黄体支持：所有FET周期内膜准备方案均为人工替代周期。于月经周期第2～4天起口服戊酸雌二醇(补佳乐，拜耳，德国)6～8 mg/d，或17β雌二醇(芬吗通，雅培，荷兰)6～8 mg/d，7～8 d后B超监测子宫内膜厚度，根据内膜厚度调整雌二醇用量，当内膜的厚度≥7 mm时，加用黄体酮(黄体酮注射液，浙江仙琚制药)进行内膜转化，4 d后选择胚胎进行移植，并继续雌激素和孕激素维持治疗。

4.冷冻胚胎的选择及分组：卵裂球数目≥6的Ⅰ级、Ⅱ级胚胎作为优质胚胎进行冷冻。复苏时，选择的胚胎为复苏后没有卵裂球损伤的6～8个细胞的优质胚胎，并进行过夜培养。经过夜培养后，卵裂球未继续生长则被剔除。移植冻融胚胎数目为1～2枚。根据移植胚胎数目不同分为A组(移植1枚胚胎，n=183)和B组(移植2枚胚胎，n=1 540)；根据冻融胚胎过夜培养后卵裂球数目是否达到翻倍或以上，分为倍增组(n=843)和未倍增组(n=361)；按照卵裂球数目是否倍增将A组细分为A1组(倍增组，n=108)和A0组(未倍增组，n=75)，B组细分为B2组(2枚胚胎均倍增组，n=735)、B1组(仅1枚胚胎倍增组，n=519)和B0组(2枚胚胎均未倍增组，n=286)。

5.随访：在胚胎移植后第14天测定血清β-HCG水平。如血清β-HCG阳性，3周后复查超声。β-HCG阳性的临床结局评价包括胚胎种植、临床妊娠、宫内多胎妊娠、流产、晚期流产、活产和早产。胚胎种植率=妊娠囊总数/移植胚胎总数×100%；临床妊娠是指超声检查发现1个或多个妊娠囊，临床妊娠率=临床妊娠周期总数/FET周期总数×100%；流产为妊娠28周前的临床妊娠丢失，流产率=流产周期总数/FET周期总数×100%；晚期流产为妊娠12周或之后但未达到28周的妊娠丢失，晚期流产率=晚期流产周期总数/FET周期总数×100%；活产率=发生活产的周期总数/FET周期总数×100%；早产率=发生早产的周期总数/活产周期总数×100%。

三、统计学分析

结 果

一、一般情况

本研究共纳入1 723个卵裂期胚胎FET周期，移植1枚胚胎周期(A组)总数为183个，移植2枚胚胎周期(B组)总数为1 540个，共移植胚胎3 263枚，种植胚胎1 409枚，胚胎种植率43.2%；临床妊娠周期数为1 041个，妊娠率60.4%；B组胚胎种植率及临床妊娠率均显著高于A组(P<0.05)(表1)。冻融胚胎过夜培养后移植胚胎卵裂球数目倍增组(A1组+B2组)周期总数为843个，未倍增组(A0组+B0组)周期总数为361个，两组患者的平均年龄、不孕年限、原发不孕比例、移植日子宫内膜厚度比较均无统计学意义(P>0.05)(表2)。

表1 移植不同数目胚胎的妊娠结局比较(%)

表2 倍增组与未倍增组患者一般情况比较[(-±s)，%]

二、冻融胚胎过夜培养后卵裂球数目翻倍生长对临床结局的影响

过夜培养后，倍增组胚胎种植率、临床妊娠率和活产率均显著高于未倍增组(P<0.05)，而两组流产率、早产率无显著性差异(P>0.05)(表3)。

表3 倍增组与未倍增组患者妊娠结局比较(%)

三、移植1枚胚胎FET周期卵裂球数目翻倍生长对临床结局的影响

移植1枚胚胎周期(A组)总数为183个，其中倍增组(A1组)108个周期，未倍增组(A0组)75个周期。A1组临床妊娠率、活产率、早产率均显著高于A0组(P<0.05)，而流产率无显著性差异(P>0.05)(表4)。

表4 移植1枚胚胎(A组)亚组妊娠结局比较(%)

四、移植2枚胚胎FET周期卵裂球数目翻倍生长对临床结局的影响

移植2枚胚胎周期(B组)总数为1 540个，其中移植2枚胚胎均倍增组(B2组)735个周期，移植2枚胚胎中仅1枚倍增组(B1组)519个周期，移植2枚胚胎均未倍增组(B0组)286个周期。3组胚胎种植率、临床妊娠率和活产率均有显著性差异(P均<0.05)，其中B2组显著高于其它2组，B0组显著低于其它2组(P<0.05)；B2组宫内多胎妊娠率显著高于其他2组(P<0.05)，B1组和B0组无显著性差异(P>0.05)；3组流产率、晚期流产率、早产率无显著性差异(P均>0.05)(表5)。

表5 移植2枚胚胎(B组)亚组妊娠结局比较(%)

讨 论

胚胎冷冻是辅助生殖技术的重要组成部分，可以用于促排卵后预防卵巢过度刺激综合征、避免高孕酮水平影响子宫内膜容受性、薄型子宫内膜、取卵并发症以及多余胚胎的保存等情况，弥补了新鲜周期的不足。与新鲜胚胎移植周期相比，FET周期的内膜生长情况更接近自然周期，可能具有更好的子宫内膜容受性。有研究表明冻融胚胎复苏后卵裂球进一步生长会使胚胎发育与子宫内膜更同步，增加妊娠几率[3]。在新鲜周期移植中，卵裂球数目正常、碎片少的优质胚胎通常有更好的发育潜能和临床妊娠结局，因此，优质胚胎冷冻后，经过复苏并在体外进行一定时间的培养，可以进一步观察其生长情况以预测其发育潜能，通常认为冻融胚胎的发育潜能是影响FET妊娠结局的重要因素。有研究发现优质胚胎复苏后发育速度不同可能影响FET妊娠结局，无损伤、发育速度快的胚胎可以有更好的妊娠结局[4-6]，但是过夜培养后的卵裂球快速分裂翻倍增殖与不能翻倍增殖的优质冻融胚胎相比，对妊娠的影响有无差异，还缺少相关的研究。因此，本研究探讨的重点是冻融胚胎过夜培养后卵裂球数目翻倍增加是否影响临床妊娠结局。

目前D3卵裂期胚胎是新鲜周期移植主要选择的胚胎发育阶段，D3优质胚胎的临床妊娠率及活产率高于非优质胚胎[7]，本研究选择新鲜周期D3卵裂期进行冷冻的优质胚胎为研究对象，按冻融胚胎过夜培养后卵裂球数目是否翻倍增殖分为倍增组和未倍增组，结果提示过夜培养后卵裂球能翻倍增殖可以预测更好的临床妊娠结局。胚胎早期卵裂球有进一步发育和分化的潜能，部分发育缓慢的冻融胚胎过夜培养后仍能继续发育和获得妊娠，而冻融优质胚胎卵裂球能够翻倍增殖对预测胚胎发育潜能具有重要的价值。有研究表明，复苏4 h胚胎即分裂的周期，其临床妊娠率显著高于未分裂者，快速恢复有丝分裂预示着更好的发育潜能和妊娠结局[8]。过夜培养后卵裂球数目翻倍增殖可能与所有卵裂球恢复有丝分裂相关。

本研究中首先分析倍增组和未倍增组，纳入的移植胚胎数目包括1枚和2枚，为了进一步分析移植不同胚胎数目时，倍增组是否仍表现出更好的临床妊娠结局，我们按移植胚胎数目不同进行了亚组分析。结果提示移植1枚胚胎时，过夜培养后倍增的胚胎仍有更高的临床妊娠率和活产率；倍增组早产率高于未倍增组，可能与纳入研究的周期总数较少有关，后续还需进一步扩大样本量进行研究。刘晓景等[9]研究分析过夜培养后移植2枚胚胎的周期，2枚胚胎均继续生长组比均未生长组的种植率和临床妊娠率更高，但该研究未分析生长胚胎的卵裂球数目与妊娠的关系。本研究结果提示，移植2枚过夜培养后的胚胎时，至少有1枚能够倍增生长就可以得到更好的临床妊娠结局，胚胎是否倍增对于妊娠结局的预测有重要意义。

多胎妊娠是FET周期的主要并发症，属于“病理产科”范畴，妊娠期及分娩期母儿风险均明显增加，也是辅助生殖治疗中亟待解决的问题[10-11]。选择性单胚胎移植作为预防性措施越来越受到关注，在新鲜周期和FET周期都能够减少多胎妊娠，改善妊娠结局[12]。提高胚胎质量并精准选择高质量胚胎移植是不降低单胚胎移植临床妊娠率和活产率的重要方法[13]。本研究发现冻融优质胚胎过夜培养后卵裂球数目翻倍增加可以预测更高的妊娠率，移植1枚卵裂球数目翻倍增加的胚胎，其临床妊娠率为45.4%，无多胎妊娠；而移植卵裂球数目均翻倍增加的2枚胚胎时，其临床妊娠率达到70.9%，但宫内多胎妊娠率也高达40.9%，远远高于自然妊娠多胎妊娠率[14]。因此，在同时复苏2枚冻融优质胚胎过夜培养后卵裂球数目均翻倍增长的情况下，可以考虑移植其中1枚胚胎，减少多胎妊娠风险，而另1枚胚胎可以选择冻回或是继续培养观察其进一步发育成囊胚的潜力。选择性单囊胚移植也可以达到提高活产率、降低多胎妊娠率的目标[15]。然而，囊胚体外培养时间更长，胚胎利用率低，患者会担心无胚胎移植的可能，会增加患者的精神压力和经济负担，使得将复苏的2枚胚胎均进行囊胚培养存在一定困难。另外，囊胚移植还增加单卵双胎发生风险及表观遗传改变风险[16]。本研究提示过夜培养后的优质胚胎如卵裂球数目翻倍增长则妊娠率明显提高。因此，可以通过短时间过夜培养观察卵裂球是否翻倍增长来制定移植策略，选择合适的移植胚胎数目，保证妊娠率的同时可以降低多胎妊娠风险及囊胚培养成本。

综上所述，冷冻胚胎复苏后的发育潜能是评价胚胎质量的关键，也是影响临床妊娠结局的重要因素。观察过夜培养的冻融优质胚胎卵裂球数目倍增情况为评估胚胎发育潜能提供了新的方法，优质胚胎复苏后卵裂球数目发生倍增增长，提示有更好的发育潜能，代表更好的胚胎质量，并能预测更好的临床妊娠结局。移植1枚倍增的冻融优质胚胎，或移植1枚倍增及1枚未倍增冻融优质胚胎便可以获得较理想的妊娠结局；移植2枚倍增的冻融优质胚胎临床妊娠率和活产率更高，但宫内多胎妊娠率亦显著增加。因此，选择其中1枚胚胎移植或进行囊胚培养是更优的选择。