HPLC-ELSD法测定玄麦甘桔颗粒中桔梗皂苷D的含量

陈 雯 刘 勋 李欣茹 程 韬 陈 凤

贵州省食品药品检验所，贵州 贵阳 550001

玄麦甘桔颗粒是由玄参、麦冬、甘草、桔梗四味药材的水煎液浓缩为稠膏，加入适量的辅料(蔗糖或糊精)制成的颗粒[1]811。处方中四味药材用量均等，玄参清热解毒,麦冬润肺养阴,甘草补脾调和诸药，桔梗能宣肺祛痰，四药合用，有清热解毒、滋阴降火、祛痰利咽的功效。但在质量标准控制上，《中国药典》2015年版通过薄层色谱和高效液相色谱法对其中玄参、甘草进行定性和定量控制，对麦冬和桔梗未进行质量控制。文献报道中，也多对甘草酸、甘草苷、哈巴苷、哈巴俄苷、肉桂酸进行研究，而未建立其中桔梗药味的质量控制方法。

桔梗有宣肺、利咽、祛痰、排脓的功效[1]277，赵秀玲[2]指出桔梗在食用和药用上都有较高的价值，其中主要活性成分为皂苷类，具备抗高温、抗水肿、抗毒、抗炎等作用。而桔梗皂苷D是桔梗皂苷中的主要皂苷[4]，本实验通过建立桔梗皂苷D的含量测定方法，为进一步评价玄麦甘桔颗粒的品质提供科学的办法。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters 2695液相色谱仪及配套工作站，蒸发光散射检测器，色谱柱为Agilent C18柱,4.6 mm×150 mm,流速1.0 mL/min。

1.2 试药 玄麦甘桔颗粒分别来自于云南白药股份有限公司(样1、样2)、葵花药业集团(重庆)有限公司(样3、样4)、太极集团重庆中药二厂有限公司(样5、样6)；桔梗皂苷D来源于中国食品药品检定研究院(批号：111851-201405，含量:93.0%)；乙腈为色谱纯，甲醇、正丁醇、氨水、等试液均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent C18(250 mm×4.6 mm 5 μm)；流动相：乙腈-水(25∶75)：蒸发光散射检测器检测；柱温30 ℃；流速：1.0 mL/min；测定法：分别精密吸取对照品溶液10 μL与供试品溶液10～20 μL，注入液相色谱仪，测定。

2.2 对照品溶液的制备 取桔梗皂苷D对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.25 mg的溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备 取装量差异项下的本品，混匀，取适量，研细，取约20 g，精密称定，置具塞锥瓶中，精密加入甲醇150 mL，称定重量，超声(功率250 w,频率35 kHz)提取30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过,精密量取续滤液100 mL，置水浴上蒸干，残渣加水20 mL使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用氨试液50 mL洗涤，弃去氨液，再用正丁醇饱和的水50 mL洗涤，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

2.4 阴性供试品溶液的制备 取缺桔梗的阴性样品，按照2.3制备成阴性供试品溶液，即得。

2.5 专属性考察 取桔梗皂苷D对照品溶液、玄麦甘桔颗粒供试品溶液及阴性供试品溶液，按照“2.1”色谱条件注入液相色谱仪，供试品溶液色谱在与对照品溶液色谱相应位置有相应的色谱峰，且阴性无干扰，如图1所示。

图1 玄麦甘桔颗粒桔梗皂苷D色谱图

2.6 线性关系考察 精密吸取桔梗皂苷D对照品溶液(0.2397 μg/mL)2 μL、4 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL依次注入液相色谱仪，测定峰面积。以对照品进样量X(μg)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归计算，得出桔梗皂苷D线性回归方程为：y=1.7258x-0.4426,r=0.9994。桔梗皂苷D在0.4794～5.9915 μg的范围内线性关系良好。

2.7 精密度试验 精密量取同一混合对照品10 μL，连续进样6次，记录色谱图峰面积，桔梗皂苷D对照品的峰面积RSD为0.5%，结果说明仪器精密度良好。

2.8 重复性试验 取同一批玄麦甘桔颗粒，按“2.3”供试品溶液制备方法制备6份，按“2.1”色谱条件测定桔梗皂苷D的含量，结果测定桔梗皂苷D平均含量43.3 μg/g,RSD为1.8%，表明方法重复性良好。

2.9 稳定性试验 取同一批玄麦甘桔颗粒，按“2.1”色谱条件，于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、18 h，测定桔梗皂苷D的峰面积，RSD为1.7%，表明供试品溶液在18 h内稳定性良好。

2.10 回收率试验 采用加样回收法.取已测定含量的玄麦甘桔颗粒(平均含量43.3 μg/g)10 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入含桔梗皂苷D对照品溶液(2.12412 μg/mL)150 mL,称定重量，自“超声处理……”起按“2.3”供试品溶液制备方法制备6份，按“2.1”色谱条件测定桔梗皂苷D的含量，计算回收率。结果表明，该方法准确度良好,见表1。

2.11 样品测定 取三家企业各2批玄麦甘桔颗粒样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”色谱条件测定桔梗皂苷D的含量， 结果见表2。

表1 桔梗皂苷D回收率试验结果

表2 三家企业样品含量结果

3 讨论

桔梗皂苷D为2015年版《中国药典》桔梗的含量控制指标，丁大勇等[3]采用75%乙醇对样品进行回流提取，提取液离心，上清液大孔树脂吸附过柱，不同浓度乙醇洗脱。文献[4]也提出了大孔吸附树脂分离桔梗总皂苷的方法。朱丹妮等[5]以甲醇为溶剂，使用超声提取法提取桔梗中的桔梗皂苷D，不进行后续纯化处理。《中国药典》桔梗项下方法最为复杂，使用50%甲醇超声提取后，对提取液进行了萃取、萃取后药液加于硅胶柱上，以三氯甲烷-甲醇不同比例混合溶液分次洗脱[1]277。

参照《中国药典》和相关文献[3-7]，考察实验条件。单纯超声提取，桔梗皂苷D和其他成分无法达到较好的分离效果；超声提取后，使用正丁醇萃取，氨试液洗涤，样品能较好分离；在此基础上分别使用大孔树脂和硅胶柱进行洗脱分离，结果大孔树脂分离的结果含量较低，硅胶柱分离结果含量与未过柱前无明显差异，故选择了更加简单、且无需使用易制毒试剂三氯甲烷的方法。

在供试品溶液制备提取溶剂的选择中，对50%甲醇、80%甲醇、甲醇、乙醇的提取效果进行比较，结果乙醇提取含量较低，而不同浓度的甲醇提取含量值无明显变化，因甲醇处理的样品容易过滤，故选择甲醇方便操作。经方法学考察，表面本法准确可靠、重复性好，灵敏度高，为今后桔梗皂苷D在制剂中的定量分析提供参考。