褐飞虱中肠两种氨肽酶N的鉴定及蛋白特性分析

林 莉, 余小强, 关 雄, 邵恩斯

(1.福建农林大学, 国家菌草工程技术研究中心, 福州 350002; 2.福建农业职业技术学院动物科技学院, 福州 350007;3.福建农林大学植物保护学院, 福州 350002; 4.华南师范大学生命科学学院, 广州 510631)

褐飞虱Nilaparvatalugens是一种在水稻上危害性极大的半翅目(Hemiptera)刺吸式口器害虫，同时，褐飞虱是多种水稻病毒的中间宿主，能够传播包括水稻齿矮病毒(rice rugged stunt virus, RRSV)及水稻草矮病毒(rice grassy stunt virus, RGSV)等多种病毒病害，对水稻生产造成严重的间接危害(Luetal., 2015)，这些都与褐飞虱消化系统中肠道内的蛋白酶密切相关。褐飞虱肠道内的蛋白酶种类众多，氨肽酶N(aminopeptidase N, APN, EC 3.4.11.2)是其中重要的一类蛋白酶(Terraetal., 1996)。APN是M1外肽酶家族中的成员，该家族蛋白多含有一个锌离子结合域HEXXHX18E和一个高度保守的GAMEN序列。研究显示上述两个保守功能域与APN酶活性密切相关(Luanetal., 2012)。APN主要以可溶性和膜结合蛋白的两种形式存在于动植物体内许多亚细胞器、细胞质和膜成分中(Thieleetal., 1997)。在昆虫体内，APN分为膜结合蛋白和可溶蛋白两类。其中膜结合APN主要存在中肠刷状缘膜表面(Terraetal., 1996)，是一种通过糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol, GPI)锚定附着在细胞膜上的糖蛋白(Knightetal., 1995)，并且优先锚定在富含胆固醇的膜上(Zhuangetal., 2002)。在昆虫体内，外源蛋白进入消化道后首先被蛋白内切酶水解成多种短肽，尔后羧肽酶及氨肽酶(包括APN)将这些短肽进一步水解成氨基酸(Wangetal., 2005)。昆虫中肠APN还被报道是多种病原物的受体或结合位点。例如，鳞翅目和双翅目昆虫中肠APN被发现参与了苏云金杆菌Bacillusthuringiensis(Bt)Cry杀虫毒素的毒理机制(Knightetal., 1994; Zhaoetal., 2017; Gómezetal., 2018; Guoetal., 2020)。在豌豆蚜Acyrthosiphonpisum等半翅目昆虫体内APN被发现是凝集素蛋白的受体(Angeluccietal., 2008; Fitchesetal., 2008)。

当前，多种昆虫中肠APN已经被鉴定并克隆(Cristofolettietal., 2003; Wangetal., 2005; Monteiroetal., 2014; Cantón and Bonning, 2019)。已鉴定出的昆虫APN的分子量约60～200 kD(Sangadalaetal., 2001; Wangetal., 2005; Monteiroetal., 2014; Cantón and Bonning, 2019)。除了从昆虫中肠提取APN之外，在大肠杆菌Escherichiacoli和动物细胞系中表达APN蛋白是获得昆虫中肠APN的重要途径(Luoetal., 1999; Zhangetal., 2008)。相较于在大肠杆菌中表达的策略，Sf9及Sf21细胞真核表达体系更有利于制备完整功能活性的APN蛋白(Luoetal., 1999; Rangeletal., 2007; Aroonkesornetal., 2015; Linzetal., 2015)。鉴于中肠APN在昆虫生理生化中的重要功能及其作为杀虫毒素的受体的潜在可能，为了研究褐飞虱中肠外肽酶对其为害水稻植株的影响，并有针对性地开发对褐飞虱高效的杀虫毒素，本研究以课题组在前期工作中鉴定的两个褐飞虱中肠apn基因作为对象，验证上述两个APN蛋白在褐飞虱中肠中的表达，并通过果蝇DrosophilaS2细胞分别表达两个NLAPN蛋白，对两个NLAPN的酶活性及细胞膜结合功能进行了验证。

1 材料与方法

1.1 试虫

褐飞虱虫源由福建农林大学福建省农业植物病毒学研究所提供。幼虫以新鲜水稻Oryzasativa为食，饲养在28℃和光周期14L∶10D条件下水培的水稻苗上。

1.2 氨肽酶N序列比对及系统进化分析

半翅目昆虫唾液腺及肠道转录组原始数据下载自NCBI序列归档片段(sequence read archive, SRA)数据库。包括褐飞虱唾液腺(SRR5149721)、褐飞虱肠道(SRR8189329)、灰飞虱Laodelphaxstriatellus唾液腺(SRR1617628)、灰飞虱肠道(SRR1617623)、豌豆蚜Acyrthosiphumpisim唾液腺(SRR7037541)、豌豆蚜肠道(SRR7037537)、褐翅椿象Halyomorphahalys唾液腺(SRX6717291，SRX6717292)及褐翅椿象肠道(SRX6717290)。经质量控制过滤后的原始数据利用Trinity Assembly(v2.8.5)在默认参数下进行组装。组装获得的contig利用编写的perl脚本去冗余后获得Unigene序列。利用BLASTx(v2.7.0)软件，分别针对NCBI非冗余蛋白数据库(non-redundant, NR)及Swiss-Prot蛋白数据库比对获得Unigene序列注释信息。将获得注释信息的Unigene所编码的蛋白提取出来获得APN蛋白氨基酸序列。利用Bowtie软件计算各转录本转录水平FPKM(fragments per kilo base per million mapped reads)值。利用RSEM(v1.3.1)(Li and Dewey, 2011)预测同一转录本在唾液腺及肠道中的相对表达量，并计算同一基因在中肠与唾液腺中的相对表达量(log2fold change, log2FC)以体现表达量差异。

利用MAFFT(v7.0)(Katoh and Standley, 2013)对褐飞虱、灰飞虱、豌豆蚜及褐翅椿象唾液腺及中肠转录组中鉴定出的APN蛋白序列比对。比对后的序列通过最大似然(maximum likelihood, ML)法进行系统进化树分析。首先，通过ModelFinder(Kalyaanamoorthyetal., 2017)对系统进化树模型参数及进化树分支方案进行预测，尔后利用IQ-TREE(Nguyenetal., 2014)进化树构建软件在10 000 ultrafast bootstraps(Minhetal., 2013)参数下构建ML进化树。将构建好的进化树上传至在线进化树注释软件Interactive Tree of Life(http:∥itol.embl.de)进行美化及标注。

1.3 NLAPN1和NLAPN4免疫定位分析

基于褐飞虱两个中肠apn基因nlapn1(GenBank登录号: MF741654.1)和nlapn4(GenBank登录号: MF741657.1)序列，委托GenScript(南京)制备NLAPN1和NLAPN4多克隆抗体。褐飞虱4龄若虫(雌雄随机)中肠刷状缘膜囊泡(brush border membrane vesicles, BBMVs)蛋白的制备参考文献(Wolfersberger, 1993; Shaoetal., 2016)的方法。提取1 500头4龄褐飞虱若虫中肠，用玻璃匀浆器彻底研磨后与等体积的24 mmol/L MgCl2混合，冰上放置15 min，再次研磨使其彻底均质化。在4℃ 2 500 g条件下离心15 min，收集上清。上清液在4 ℃ 30 000 g下离心30 min，弃上清。沉淀重悬于300 μL Lysis Buffer[20 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA(pH 8.0), 1 mmol/L MgSO4, 0.01% NaN3, 10%甘油, 2% CHAPS, 1 mmol/L PFSM, 1×Protease Inhibitor Cocktail, 罗氏, 美国]并存于-80℃备用。褐飞虱中肠BBMVs样品在10%的SDS-PAGE凝胶上电泳分离后，利用半干式转膜仪(DYCP-40C，六一，北京)将凝胶上蛋白样品转移到PVDF膜上。PVDF膜用封闭液(PBS, pH 7.4, 5%脱脂奶粉, 0.01%吐温20)于37℃封闭2 h。尔后用NLAPN1或NLAPN4多克隆抗体在室温条件下孵育2 h，并用携带碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)标记的羊抗兔抗体(Sigma，美国)室温孵育1.5 h。清洗后的PVDF膜用AP显色试剂盒(Bio-Rad，美国)显色观察。

1.4 LC-ESI-MS/MS鉴定NLAPN1和NLAPN4

从1.3节中的SDS-PAGE凝胶中切除目的蛋白条带，利用液相-电喷雾电离串联质谱(liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry, LC-ESI-MS/MS)进行序列与分子量的测定。相关测定委托诺禾生物有限公司(中国)完成。

1.5 NLAPN1和NLAPN4表达载体的构建

基于褐飞虱两个中肠apn基因nlapn1(GenBank登录号: MF741654.1)和nlapn4(GenBank登录号: MF741657.1)序列，委托生工生物有限公司(Sangon Biotech，上海)将nlapn1和nlapn4分别连接pUC18质粒。设计5′端带有FLAG标签的nlapn1及nlapn4的引物(表1)分别克隆5′端带有FLAG标签序列且移除自身信号肽序列的两个nlapn基因。同时，将引物NLAPN4-R替换为NLAPN4lackG-R克隆3′端不带有GPI锚定信号肽序列的nlapn4lackG全长序列。将扩增的nlapns基因通过KpnⅠ和NotⅠ位点插入pMT/BiP/V5-His载体中，构建重组质粒pMT-nlapn1, pMT-nlapn4和pMT-nlapn4lackG。3个重组质粒的3′端均带有V5标签序列，5′端带有FLAG标签，可用于后续利用标签抗体检测目的蛋白。上述克隆过程分别采用携带nlapn1和nlapn4的pUC18质粒作为模板DNA。PCR反应体系(50 μL): 引物终浓度25 pmol/L, 高保真pfu DNA聚合酶(TaKaRa, 北京)5 U。PCR反应条件: 95℃ 2 min; 95℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72℃ 2 min, 30个循环; 72℃ 10 min。

表1 引物

1.6 NLAPN1和NLAPN4在果蝇S2细胞中表达和定位

果蝇S2细胞购于ThermoFisher中国公司。S2细胞在SFX-Insect(HyClone，美国)培养液中于28℃环境中培养。用TransIT-LT1转染试剂(Mirus Bio，美国)将1.5节中构建的重组质粒pMT-nlapn1, pMT-nlapn4和pMT-nlapn4lackG转染到3×106的S2细胞中，转染步骤按试剂盒说明书执行。转染12 h后转移转染复合物至含有500 μmol/L CuSO4的新鲜的培养基中培养72 h。将重悬后的S2细胞在2 000 g 4 ℃下离心3 min，收集含有分泌蛋白的胞外培养基。离心后的S2细胞沉淀清洗后用PBS重悬(135 mmol/L NaCl, 2 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na2HPO4, 1.7 mmol/L KH2PO4, pH 7.4)，并通过超声波破碎仪(SCIENTZ-IID，新芝，宁波)超声波处理(3×10 s, 3 min)。经4℃ 12 000 g离心10 min。上清用0.45 μm的过滤膜(Millipore Sigma, 美国)过滤，作为细胞裂解物的可溶组分。沉淀清洗3次后重悬于PBS(1∶10, w/v)中，作为细胞裂解物的不溶组分。分别将上述转染细胞的可溶组分、不可溶组分及胞外培养基于10%的SDS-PAGE凝胶分离后，利用半干式转膜仪(DYCP-40C，六一，北京)转移到PVDF膜上。PVDF膜用封闭液(PBS, pH7.4, 5%脱脂奶粉, 0.01%吐温20)于37℃封闭2 h。尔后分别用鼠源抗V5标签和FLAG标签单克隆抗体(Sigma，美国)在室温条件下孵育2 h，并用携带AP标记的羊抗兔抗体(Sigma，美国)室温孵育1.5 h。清洗后的PVDF膜用AP显色试剂盒(Bio-Rad, 美国)显色观察，鉴定NLAPN1及NLAPN4蛋白在各组分中的分布。

将转染60 h后的S2细胞接种于盖玻片上，28℃孵育过夜。贴壁于盖玻片上的细胞用0.1 mol/L PBS(pH 7.4)清洗后于4%多聚甲醛溶液室温反应30 min。再次清洗后室温条件下在0.1% Triton X-100中反应15 min后在包含鼠源抗FLAG标签或抗V5标签单克隆抗体(Sigma，美国)的缓冲液(3% BSA, 0.01 mol/L PBS, pH 7.4)中孵育2 h，再次清洗后在含有异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)的兔抗鼠二抗(TransGen Biotech，北京)中室温孵育2 h，用共聚焦显微镜(LSM5 Pascal, Zeiss)在激发光下进行检测。同时，以转染pMT/BiP/V5-His的S2细胞作为阴性对照，分析NLAPN1和NLAPN4在果蝇S2细胞中的定位。

1.7 NLAPN1和NLAPN4活性检测

收集1.6节转染后孵育72 h的S2细胞，用PBS清洗3次后在NP-40裂解缓冲液(1∶10, w/v)(Invitrogen，美国)中冰上孵育1 h。经16 000 g 4℃条件下离心10 min，收集细胞裂解液，以未转染的S2细胞裂解液作为阴性对照，分别添加底物L-亮氨酸对硝基苯胺(leucine-p-NA)、L-丙氨酸4-硝基苯胺盐酸盐(Ala-p-NA)、L-甲硫氨酸对硝基苯胺盐酸盐(Met-p-NA)和L-赖氨酸对硝基苯胺二氢溴酸盐(Lys-p-NA)进行酶促反应，3次重复，利用酶标仪(Spark 10 mol/L, Tecan)在405 nm，26℃条件下检测10 min(每10 s测定一次)。每分钟水解1 μmol底物所需的样品量定义为各样品中单位酶活性(U)。

2 结果

2.1 NLAPN1和NLAPN4的系统进化

基于褐飞虱、灰飞虱、豌豆蚜及褐翅椿象中肠及唾液腺转录组数据鉴定出多个APN蛋白，并通过FPKM值的计算对这些APN蛋白在其来源昆虫肠道与唾液腺中的转录水平进行了预测分析。结合系统进化分析与转录水平分析可以发现，上述半翅目昆虫消化系统中的APNs蛋白在系统进化树中被分成两个分支。分支A中的APN在肠道中的转录水平均高于其在唾液腺中的转录水平。分支B中的多数APN在两个组织中的转录水平分布则与分支A截然相反，即唾液腺中的转录水平高于肠道中的转录水平。NLAPN1及NLAPN4在该系统进化树中与其他在肠道高表达的APN同属于分支A(图1)。

图1 最大似然法构建的基于氨基酸序列的4种半翅目昆虫APN蛋白系统进化树(10 000次重复)

2.2 褐飞虱中肠BBMV中NLAPN1和NLAPN4的定位

Western blot分析结果表明，分别以兔源NLAPN1及NLAPN4多克隆抗体作为一抗，均能够与褐飞虱中肠BBMV在160, 90及50 kD位置鉴定出免疫显色信号(图2)。LC-ESI-MS/MS鉴定到160 kD的能够与NLAPN1及NLAPN4氨基酸序列相匹配的肽段(结果未显示)。结果证明NLAPN1及NLAPN4存在于褐飞虱中肠BBMV中。

图2 褐飞虱4龄若虫中肠刷状缘膜囊泡中NLAPN1(A)与NLAPN4(B)的Western blot鉴定

2.3 重组NLAPN1和NLAPN4在果蝇S2细胞中的表达

Western blot检测结果显示，以FLAG标签抗体作为一抗时在表达NLAPN1或NLAPN4蛋白S2细胞裂解物的细胞可溶组分及不可溶组分中均能够观察到130 kD(NLAPN1)或160 kD(NLAPN4)的条带，在胞外培养基中上述条带均未显示(图3: A)，但能够检测到极强的160 kD的不带有C端GPI锚定信号肽的NLAPN4lackG条带。以V5标签抗体作为一抗时，在细胞可溶组分、不可溶组分和胞外培养基中均未检测到NLAPN1和NLAPN4，但能够在胞外培养基中检测到NLAPN4lackG(图3: B)。上述结果说明NLAPN1及NLAPN4均能够表达并存在于S2细胞裂解物的胞内或细胞不可溶组分中。免疫荧光定位结果也表明，以FLAG标签抗体作为一抗，表达了NLAPN1或NLAPN4的S2细胞在细胞膜结构位置均有明显的绿色荧光(图4)，表明NLAPN1和NLAPN4均位于S2细胞膜上；而以V5标签抗体作为一抗时，未能在S2细胞中观察到免疫荧光(图4)。表达了NLAPN4lackG蛋白的S2细胞无论以FLAG标签抗体还是V5标签抗体作为一抗，均能够在细胞质中检测到免疫荧光(图4)。

图3 褐飞虱NLAPN1和NLAPN4在果蝇S2细胞中的表达鉴定

图4 褐飞虱NLAPN1和NLAPN4在果蝇S2细胞中的免疫荧光定位

2.4 NLAPN1和NLAPN4的氨肽酶活性

结果显示,以L-丙氨酸4-硝基苯胺盐酸盐及L-赖氨酸对硝基苯胺二氢溴酸盐作为底物时，表达了NLAPN1或NLAPN4的S2细胞裂解液中均能够检测到一定的酶活性，其中NLAPN4的酶活性高于NLAPN1(图5)。以L-亮氨酸对硝基苯胺作为底物时，表达了NLAPN1的S2细胞裂解液显示出极高的酶活性(>60 U/mg)，高于表达了NLAPN4的S2细胞裂解液(图5)。以L-甲硫氨酸对硝基苯胺盐酸盐作为底物时，表达了NLAPN1与NLAPN4的S2细胞裂解液中均未能够检测出酶活性(图5)。上述结果说明NLAPN1及NLAPN4对部分氨基酸位点能够体现出氨肽酶活性。

图5 以不同化合物作为底物时褐飞虱NLAPN1和NLAPN4的酶活性

3 讨论

APN在昆虫肠道、唾液腺等组织中均有表达，是昆虫消化系统中重要的一类蛋白酶(Cravaetal., 2010; Ningshenetal., 2013)。在前期工作中我们已通过RNA测序的手段对褐飞虱的中肠转录组进行分析。结合已公布的褐飞虱基因组信息验证了nlapn1与nlapn4基因在中肠中的转录。作为前期工作的延续，本研究继续对NLAPN1及NLAPN4的功能进行分析与验证。有研究表明昆虫体内的APN蛋白多存在于肠道内(Terra and Ferreira, 1994; Terraetal., 1996)或唾液腺中表达(Huangetal., 2018)。本研究引入已公布的褐飞虱中肠及唾液腺转录组数据，结合同为半翅目刺吸式口器的灰飞虱、褐翅椿象及豌豆蚜的唾液腺与肠道转录组数据进行消化系统APN遗传进化分析，分析结果进一步从遗传进化角度证明NLAPN1及NLAPN4属于肠道APN(图1)。对褐飞虱中肠BBMV的Western blot及LC-ESI-MS/MS分析结果亦从蛋白质层面证明NLAPN1和NLAPN4在褐飞虱中肠中的表达(图2)。昆虫中肠BBMV中的APNs分子量多在60～200 kD之间(Sangadalaetal., 2001; Wangetal., 2005)。NLAPN1及NLAPN4在S2细胞内表达后的片段分别约为130和160 kD(图3)，符合昆虫中肠BBMV中APN的分子量范围。以上结果进一步验证了两个APN蛋白在褐飞虱中肠中的表达。

昆虫中肠APN多属于膜结合蛋白，依靠GPI锚定在上皮细胞膜上(Knightetal., 1995)。GPI锚定信号肽的预测结果显示NLAPN1及NLAPN4的C端均存在一个GPI锚定信号序列(Shaoetal., 2018)。本研究对NLAPN1及NLAPN4的膜结合特征进行了生物学验证。以融合蛋白N端的FLAG标签抗体作为一抗对表达了NLAPN1或NLAPN4的果蝇S2细胞进行鉴定的结果显示，NLAPN1和NLAPN4在S2细胞的不可溶组分及可溶组分中均能够被鉴定到，但在胞外组分中却不存在(图3: A)。由于瞬时表达的NLAPN1及NLAPN4均以pMT/V5-His载体的BiP作为信号肽，不带有两个APN蛋白自身的信号肽序列。上述结果证明两个APN能够顺利在S2细胞内的核糖体表达并转运至细胞膜表面。以融合蛋白C端的V5标签抗体作为一抗时，NLAPN1及NLAPN4均无法在细胞可溶组分、不可溶组分及胞外组分中被检测到(图3: B)。由于GPI锚定蛋白在锚定到细胞膜上时会切割蛋白C端的GPI锚定信号肽。因此，切割C端GPI锚定信号肽的NLAPN1及NLAPN4丢失了C端的V5标签，无法被V5标签抗体所检测到，间接证明了两个褐飞虱中肠APN蛋白的GPI锚定特性。以FLAG标签或V5标签抗体对表达了NLAPN4lackG的S2细胞进行检测的结果显示，不带有GPI锚定信号肽的NLAPN4lackG主要存在于胞外组分中，少量存在于胞内组分(图3)。由于NLAPN4lackG不带有C端的GPI锚定信号肽，因此NLAPN4lackG无法定位在细胞膜上，且C端的V5标签不会因为GPI锚定作用而丢失，进一步确认了NLAPN4是通过GPI锚定在细胞膜上的。共聚焦显微镜对NLAPN1及NLAPN4在S2细胞中的定位结果显示NLAPN1及NLAPN4均主要分布于转染后的细胞膜上，而NLAPN4lackG则仅能够在细胞质中被鉴定到(图4)。该结果再次验证了两个APN蛋白的膜结合特性。由于细胞外组分体积较大，因此NLAPN4lackG的荧光信号未能在胞外组分中鉴定到(图4)。基于对转染后的S2细胞组分的Western blot分析及共聚焦免疫荧光定位结果均证明NLAPN1及NLAPN4是通过GPI锚定在细胞膜上的膜结合蛋白。

APN是一类蛋白外肽酶，能从蛋白质和多肽N端选择性切除氨基酸残基产生游离氨基酸，昆虫中肠不同APN单体对蛋白及短肽N端残基有着不同的酶活偏好性(Luetal., 2020)。丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、精氨酸等12种氨基酸残基都属于APN的偏好水解的残基位点(Barrett and McDonald, 1982; Xu and Li, 2005)。酶活鉴定结果显示，NLAPN1在leucine-p-NA作为底物时有较强的酶催化活性，NLAPN4在Ala-p-NA及Lys-p-NA做底物时均能检测出酶催化活性，但在leucine-p-NA作为底物时几乎没有活性(图5)。上述结果说明两个褐飞虱中肠APN均具备氨肽酶活性，且NLAPN1偏好水解亮氨酸残基位点。对两个褐飞虱中肠APN酶活的鉴定与分析进一步验证了两个蛋白在褐飞虱中肠中的氨肽酶功能。鳞翅目昆虫主要以植物叶片为食，而褐飞虱主要以水稻茎杆韧皮部汁液为食。一般认为，飞虱、叶蝉、蚜虫等半翅目刺吸式口气昆虫取食植物韧皮部汁液中以糖为主，缺少蛋白质与淀粉(Akman Gündüz and Douglas, 2009)。本研究发现褐飞虱中肠中高表达的NLAPN1具有与鳞翅目昆虫肠道中重要APN近似的酶活性，说明虽然取食主要成分不同，但不同昆虫的消化系统中氨肽酶都是十分重要的一类消化蛋白酶。

在鳞翅目、鞘翅目、双翅目部分昆虫中肠中APN被鉴定为Bt Cry杀虫毒素的受体蛋白(Gómezetal., 2018; Guoetal., 2020)。本研究对两个NLAPN的蛋白特性鉴定结果发现，NLAPN1具有与鳞翅目昆虫肠道Cry毒素受体APN近似的分子量大小，且同样具备亮氨酸位点外肽酶催化活性。同时NLAPN1也具备GPI锚定膜结合蛋白的特性。因此，NLAPN1具有成为Bt Cry毒素结合位点诱发Cry毒素毒性作用的可能性。两个中肠上皮细胞膜上的GPI锚定APN的鉴定能够为深入研究褐飞虱消化系统生理生化特性，褐飞虱与水稻之间的关系提供依据，为后续开发对褐飞虱高效的新型毒素蛋白提供帮助。