保护剂提高皮革用蛋白酶稳定性的研究

吴芳彤，曹倩荣，郑翔，刘春卯，秦梦，王力源

（河北省微生物研究所，河北 保定 071051）

制革工业相对于新型产业来说，依然是一个高污染的“粗放型”工业，其产生的废水、废物、废气等污染主要来自灰碱法脱毛。灰碱法脱毛是目前皮革企业普遍采用的脱毛方法，其优点是效果好、成本低，但由于硫化物和石灰的使用，以及大量毛蛋白溶于废水中，使排放的废水含有大量S2-、有机物、固体悬浮物、碱性污泥等，该步骤排放的污染物可占整个制革过程排污量的80%～90%[1-4]。作为化学脱毛的替代方法，目前有氧化脱毛法、酶法脱毛、有机脱毛法等，其中酶法脱毛是近些年来最有可能替代灰碱法脱毛的一种清洁化脱毛技术[5]。

我国酶法脱毛的研究始于20世纪50年代，到七八十年代已筛选出多株适用于不同产品的脱毛酶，如枯草芽孢杆菌AS1.398中性蛋白酶、微白链霉菌166中性蛋白酶、矮小芽孢杆菌209碱性蛋白酶[6]。但这些酶制剂产品并未在皮革行业得到大规模推广，其原因在于其酶系中含有水解皮胶原的胶原蛋白酶，在脱毛的同时也会水解皮面的胶原蛋白，在脱毛生产中工艺控制不严格很容易造成皮面松弛、烂皮的现象[7]；还有一个原因在于经济成本过高，相对于灰碱法而言酶制剂价格较贵，且酶只在特定的温度和pH范围内才能发挥作用，对设备和操作要求相对严格，投入成本高[8，9]。当前提高酶稳定性的方法有基因工程、蛋白质工程、化学修饰、固定化、添加保护剂等，其中添加保护剂是一种简便、高效且经济的手段。Sudeep P.George等[10]研究了嗜碱嗜热单孢菌在80℃时热稳定性，结果表明山梨糖醇，甘露醇、甘油和甘氨酸可提高嗜碱嗜热单孢菌的热稳定性。Nirmal Nilesh P.等[11]发现在50℃时添加50%海藻糖和50%山梨糖醇，与未添加任何助剂相比真菌碱性蛋白酶残留活性提高了5倍。刘朝辉等[12]研究了多种保护剂对β-甘露聚糖酶热稳定性的影响，结果表明添加蔗糖、壳聚糖、甘油、山梨醇或复合保护剂均能使β-甘露聚糖酶的最适反应温度从原来的50℃提高到60℃左右。

针对蛋白酶制剂在脱毛工艺中应用的局限性，本实验室前期构建了一株脱毛用工程菌WB800N/pHT43-npr，其发酵生产的蛋白酶（JW-3）经酶学特性及脱毛应用研究表明，水解胶原蛋白能力较差，在pH 6～7稳定性良好，且其脱毛效果与传统灰碱法脱毛的皮粒面效果相当[13，14]。但JW-3蛋白酶耐受性相对较差，在脱毛应用中温度与pH的变化易使其酶活性大大降低，影响其脱毛效率。为进一步提高JW-3蛋白酶的稳定性，为脱毛酶液的循环利用提供理论支撑，本文利用单因素结合响应面优化筛选可提高JW-3蛋白酶稳定性的保护剂，并对添加保护剂后的JW-3蛋白酶的热稳定性、酶失活动力学参数等进行研究，提升JW-3蛋白酶在皮革脱毛工艺中的应用性能，从而降低了酶法脱毛生产成本，促进清洁化酶制剂在皮革脱毛工艺的推广应用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

枯草芽孢杆菌工程菌Bacillus subtilis（WB800N/pHT43-npr），由本研究室与中国科学院微生物研究所共同构建，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCC No.11625。工程菌WB800N/pHT43-npr的发酵液经固液分离获得上清液即为JW-3蛋白酶。

1.1.2 试剂

福林试剂、碳酸钠、三氯乙酸、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、酪蛋白、甘油、二甲基亚砜（DMSO）、无水乙醇、1,2-丙二醇均为国药分析纯；甘露醇、聚乙二醇（PEG）2000购自北京酷来博生物技术有限公司；海藻糖购自生工生物工程（上海）股份有限公司；蔗糖、葡萄糖购自Sigma-Aldrich贸易有限公司；山梨醇、甘露糖购自北京博奥拓达科技有限公司；乳糖购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；果糖购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 试验仪器与设备

DZKW-4电热恒温水浴锅，北京中兴伟业仪器有限公司；ZXRD-A7230恒温鼓风干燥箱，上海智城分析仪器制造有限公司；PHS-25 pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；TD10002G电子天平，天津天马衡基仪器有限公司；JA2003A电子精密天平，天津天马衡基仪器有限公司；H3018DR高速冷冻离心机，上海知信实验仪器技术有限公司；ZWY-2012C振荡培养箱，上海智城分析仪器制造有限公司；LH-3BA紫外可见智能型多参数水质测定仪，北京连华永兴科技发展有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 J W-3蛋白酶酶活的测定

JW-3蛋白酶酶活的测定方法，参照《GB/T 23527-2009蛋白酶制剂》中附录B的方法。酶活保存率的计算公式：w(%)=Ai/A0×100（w：酶活保存率；Ai：不同温度下保存后的酶活力；A0：初始酶活力）。

1.3.2 J W-3蛋白酶的热稳定性

将JW-3蛋白酶液分别置于35、40、45、50、55、60℃下保温6 h，每间隔1 h取样检测酶活，计算酶活保存率。

1.3.3 添加保护剂对J W-3蛋白酶热稳定性的影响

1.3.3.1 单一保护剂对JW-3蛋白酶热稳定性的影响

在50℃下，分别研究醇类、糖类和有机溶剂三类保护剂对JW-3蛋白酶稳定性的影响，选出可提高JW-3蛋白酶稳定性的单一保护剂，并进行单因素浓度梯度实验。

按照0、5%、10%、15%、20%、25%、30%的比例分别在JW-3蛋白酶中添加醇类（山梨醇、甘露醇、无水乙醇和1,2-丙二醇）、糖类（海藻糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖、乳糖和果糖）和有机溶剂（甘油、二甲基亚砜（DMSO））；按照0、2%、4%、6%、8%、10%的比例在JW-3蛋白酶中添加聚乙二醇（PEG）2000。50℃恒温水浴保存6 h，测定上述不同添加量的酶活，计算酶活保存率，以不加保护剂的酶液作对照，筛选出效果最优的保护剂并确定最适添加量。

1.3.3.2 复合保护剂的筛选

根据单因素优化的实验结果，采用中心组合设计（CCD）响应面法优化复合保护剂配比。

1.3.4 添加保护剂对酶热稳定性的影响

取适量已添加保护剂的JW-3酶液分装于离心管中，分别置于35、40、45、50、55、60℃，6个不同温度的水浴锅中，定时取样检测酶活力，计算酶活保存率。

失活速率常数（K）的测定[15]：对于一级反应，由速率方程lnA=-kt可求得k，其中，A为酶活保存率(%)；t为失活时间（h）。半衰期(t1/2)的测定：特定温度下酶活降低一半所需要的时间，对于一级反应，t1/2=0.693/k。

2 结果与讨论

2.1 JW-3蛋白酶热稳定性

JW-3蛋白酶主要应用在皮革脱毛工艺，在工厂化脱毛过程中因操作粗放，调控不及时等因素，常常造成酶失活率较高，从而导致应用效果不稳定。因此，本文首先对JW-3蛋白酶的热稳定性进行了全面的分析，如图1所示。在35℃时JW-3蛋白酶相对稳定，失活率较小，保温6 h酶活保存率高达93.88±2.97%；在40和45℃时JW-3蛋白酶稳定性相对较差，保温6 h酶活保存率分别为60.08±1.18%和58.34±0.08%；在50℃以上，JW-3蛋白酶热稳定性极差，50℃保温6 h酶活保存率仅为16.91±1.33%，在55℃和60℃时保温6 h酶活保存率基本为0。

图1 JW-3蛋白酶热稳定性试验Fig.1 The thermos stability of JW-3 protease

在酶法脱毛中多将温度控制在35℃左右，但JW-3蛋白酶在35℃时稳定性良好，短时间内酶活波动不大，因此为了快速筛选出提高JW-3蛋白酶热稳定性的保护剂，本文选择在50℃下展开研究。

2.2 添加保护剂对JW-3蛋白酶热稳定性的影响

2.2.1 添加单一保护剂对J W-3蛋白酶热稳定性的影响

本文考察了在50℃下，不同种类、不同浓度梯度的单一保护剂对JW-3热稳定性的影响，结果如图2-图4所示。醇类中聚乙二醇2000、无水乙醇和1，2-丙二醇（如图2所示）对JW-3蛋白酶的热稳定性具有抑制作用，山梨醇和甘露醇对JW-3蛋白酶的热稳定性具有显著的促进作用。其中添加25%的山梨醇效果最佳，在50℃放置6 h后JW-3蛋白酶的酶活保存率为78.50±0.89%，与对照组（不添加任何保护剂的JW-3蛋白酶50℃放置6 h，酶活23.09±1.84%）相比酶活保存率提高了约55.41%。Kumar等[16]研究了山梨醇可提高α-糜蛋白酶的热稳定性，并通过光谱学方法分析了两种稳定剂存在时可以阻止蛋白在高温环境中变性。山梨醇作为多羟基化合物，能与酶分子形成氢键，稳定酶分子结构。本文山梨醇的加入可能在高温下阻止了JW-3蛋白酶构象的变化，保护酶的天然构象，使其结构更紧凑，从而维持其活性中心不变性。

图2 醇类保护剂对JW-3蛋白酶热稳定性的影响Fig.2 The effects of alcohol protective agents on thermal stability of JW-3 protease

如图3所示，共考察的6种糖类保护剂对JW-3蛋白酶的热稳定性均具有促进作用，其中以添加葡萄糖的效果最佳，添加25%的葡萄糖其酶活保存率可达81.43±1.86%，与对照组（酶活23.09±1.84%）相比酶活保存率提高了约58.34%。糖类保护剂对JW-3蛋白酶的热稳定性作用的原因可能是由于糖类物质主要通过结构中的羟基与细胞膜、细胞器膜或蛋白质极性基团形成众多氢键或在蛋白质表面形成水化层，从而保护细胞（器）膜及蛋白质生物大分子的结构稳定性[17，18]。

图3 糖类保护剂对JW-3蛋白酶热稳定性的影响Fig.3 The effects of carbohydrate protective agents on thermal stability of JW-3 protease

本文共研究了2种有机溶剂对JW-3蛋白酶热稳定性的影响（如图4所示），甘油对JW-3蛋白酶的热稳定性具有促进作用，DMSO对JW-3蛋白酶具有抑制作用。当甘油添加量为15%时，50℃放置6 h后酶活保存率可达46.74±0.54%，与对照组（酶活23.90±1.20%）相比酶活保存率提高了约22.84%。

图4 有机溶剂类保护剂对JW-3蛋白酶热稳定性的影响Fig.4 The effects of organic solvent on thermal stability of JW-3 protease

2.2.2 复合保护剂对J W-3蛋白酶热稳定性的影响

基于单因素试验结果，以酶活保存率（Y）为响应值，运用Design-Expert8.0.6对山梨醇添加量（X1）、葡萄糖添加量（X2）和甘油添加量（X3）进行响应面优化，本文响应面优化采用中心组合设计（CCD），涉及立方点±1、轴向点±α以及中心点0，当因素为3的时候α为1.682。因此实验设计见表1，响应值见表2。

表1 响应面试验因素与水平Tab.1 Factors and levels of response surface experiments

表2 响应面优化试验设计与结果Tab.2 Design and results of response surface methodology

根据实验结果，采用逐步回归的方法进行二次回归分析，剔除不显著的因素，得到的回归方程如下式：Y=80.71+2.40A+4.25B-0.63C-2.17AC-3.38BC-2.45A2-1.84B2-1.64C2

对该模型方程进行方程分析和显著性分析，结果见表3。模型F=7.55，P=0.0020＜0.01极显著，负相关系数R2=87.18%，校正决定系数RAdj2=75.63%，表明75.63%的变化可以由此模型解释，说明模型的拟合程度较好，能很好地反映山梨醇添加量（X1）、葡萄糖添加量（X2）和甘油添加量（X3）对酶活保存率的影响。其中山梨醇添加量（X1）和葡萄糖添加量（X2）之间交互作用极显著（P＜0.01），葡萄糖添加量（X2）和甘油添加量（X3）之间交互作用显著（P＜0.05）。失拟项（P=0.1162＞0.05）不显著，表明未知因素对实验结果影响较小。

表3 二次逐步回归模型方差分析Tab.3 Variance analysis of the stepwise regression quadratic model

观察两因素交互作用对响应值的影响可采用降维分析（dimension reduction analysi，DRA），即其他因素保持在零水平情况下，观察两个因素交互作用对响应值的影响并得到其响应面及等高线见图5。

图5 山梨醇、葡萄糖和甘油添加量交互作用对酶活保存率影响的响应面及等高线图Fig.5 Response surface plots and contour lines of interaction between sorbitol,glucose and glycerol addition

通过Design-Expert8.0.6对该模型进行分析，获得多组最优解，选取预测响应值最高的前三组分别为X1=13.34%、X2=24.79%、X3=0.01%。为方便操作，将各保护剂的添加量进行了修正，即山梨醇（X1）13%和葡萄糖（X2）25%，在此条件下进行了3次验证试验，其酶活保存率为85.73±1.28%，与预测值84.47%无显著性差异。在单因素试验中，添加25%的葡萄糖其酶活保存率可达81.43±1.86%，在实际脱毛应用中考虑到成本的因素，最终确定JW-3蛋白酶的保护剂为25%葡萄糖。

2.3 添加25%葡萄糖对JW-3蛋白酶热稳定性的影响

如图6所示，加入25%葡萄糖在不同温度下保温6 h后，JW-3蛋白酶的热稳定性显著提高。与未添加保护剂的JW-3蛋白酶相比，在35～50℃时JW-3蛋白酶稳定性较好，酶活损失较少，保温6 h酶活保存率分别为102.374.54%、82.54±4.26%、78.89±0.58%和66.33±0.05%；55℃时保温6 h酶活保存率为18.76±0.80%，而相同温度未添加保护剂的JW-3蛋白酶在2 h时酶活仅存0.88±0.05%。实验表明，添加25%葡萄糖可以显著提高JW-3蛋白酶的热稳定性，拓宽了JW-3蛋白酶在脱毛应用中的温度范围，提高了酶的稳定性，有利于开展脱毛含酶废液循环利用技术，进一步降低脱毛成本。

图6 添加25%葡萄糖对JW-3蛋白酶热稳定性的影响Fig.6 The effect of adding 25%glucose on thermo stability of JW-3 protease

表4为JW-3蛋白酶的热失活动力学参数，从表中可以看出，添加25%葡萄糖后JW-3蛋白酶的半衰期显著提高，热失活速率常数大幅度降低。当温度高于40℃时添加25%葡萄糖的JW-3蛋白酶与未添加的JW-3蛋白酶相比其半衰期分别提高了1.00倍、2.60倍、1.25倍和2.13倍。

表4 JW-3蛋白酶热失活动力学参数Tab.4 Kinetic parameters for thermal inactivation of JW-3 protease

3 结论

针对目前皮革企业酶法脱毛效果不稳定、成本高的问题，本文研究了醇类、糖类和有机溶剂对脱毛用JW-3蛋白酶稳定性的影响，经单因素试验筛选出了3种可显著提高JW-3蛋白酶稳定性的保护剂，响应面优化后得到复合保护剂的配方为：山梨醇13%和葡萄糖25%。复合保护剂的添加可显著提高JW-3蛋白酶（酶活保存率为85.73±1.28%）的稳定性，与未添加任何保护剂（酶活保存率为23.90±1.20%）相比，50℃保存6 h后其酶活保存率提高了61.83%。但本文所研究的JW-3蛋白酶主要应用于皮革脱毛中，综合考虑在今后皮革脱毛应用中的操作与成本，最终选择25%的葡萄糖作为JW-3蛋白酶的热稳定保护剂。

本文考察了添加25%葡萄糖对JW-3蛋白酶热稳定性的影响。加入25%葡萄糖后JW-3蛋白酶的热失活速率常数大幅度下降，且随温度的升高下降幅度变大，当温度为45、50、55和60℃时，添加保护剂与未添加保护剂的JW-3蛋白酶相比半衰期分别提高了1.00倍、2.60倍、1.25倍和2.13倍。

本文筛选出的保护剂与JW-3蛋白酶结合应用在脱毛工艺中，可降低因高温而造成的脱毛效果不稳定的问题，并且添加保护剂后的JW-3蛋白酶在35℃水浴6 h酶活保存率仍在100%左右，可考虑开展JW-3蛋白酶循环利用脱毛工艺，该工艺可大大降低酶法脱毛中酶制剂的使用成本，提高皮革企业开展清洁化脱毛工艺的积极性和主动性。