衍生于咔唑的双氰基二苯代乙烯型双光子荧光脂筏探针

黄池宝，康 帅，潘 淇，吕国岭

（1.遵义师范学院信息工程学院,遵义 563002；2.韶关大学英东生物与农业学院,韶关 512005）

脂筏（Lipid raft，10～100 nm的膜片）是质膜中富含鞘糖脂和胆固醇［1，2］的刚性隔膜（有序液相，lo），漂浮在甘油磷脂（无序液相，ld）的海洋中［3～7］.脂筏的结构特点与组分适于蛋白质间的相互作用与构象转化，参与许多细胞过程，如信号传导、病原体侵入、胆固醇稳态及神经退行性疾病（阿尔茨海默症和朊病毒病）等.甘油磷脂由与磷酸基团相结合的极性头部（亲水端）和2个非极性尾部（脂肪酸链、亲脂端）组成，鞘磷脂为鞘氨醇的衍生物，这2类脂极性较强；含有4个碳环且分子刚性很强的胆固醇带有1个亲水头部（含1个羟基），极性很弱，黏度很大.因此，脂筏的极性要比甘油磷脂的海洋小得多，且黏度相对较大.使用2个近红外光子激发的双光子显微镜（TPM）［8～11］可以实现对微观客体的实时动态三维（3D）成像［12］，为脂筏的生物研究提供有利工具［13～17］.本课题组［18，19］最近报道了2个溶剂生色（极性）探针（供体-桥-受体和D-π-A），其宽的溶剂生色范围与高的双光子发射截面（Φδ）成为脂筏成像的首选工具.进一步对原探针分子结构进行改造与修饰，引入了一个亲脂性长碳链（C8H17），旨在提高探针与细胞质膜（双脂分子层）的相容性.另外，用稠环咔唑替换苯环以增大分子平面刚性，不仅可以提高探针分子的双光子吸收截面，发出更强的荧光，增加灵敏度，而且可以缩小水溶液极性（或细胞液极性）对探针荧光的影响［20］，显著提高探针对脂筏的特异性识别，增强检测的准确度.基于上述两点，本文在双光子荧光母体4-甲基-2，5-二氰基-4′-氨基二苯乙烯（DCS）［20］的基础上制备了一个“开-关”双光子荧光脂筏探针（E）-2-甲基-5-｛2-［9-正辛基（3-咔唑基）］乙烯基｝对苯二甲腈（DLR，结构见Scheme 1）.DLR的双光子发射截面是已报道的同类探针中最大的.探针的发射截面越大，则其灵敏度、准确度、成像清晰度与分辨率越高；DLR具有宽广的溶剂生色范围，从环己烷中的422 nm到二甲基亚砜（DMSO）中的581 nm，显著提高了DLR对介质极性响应的灵敏度，从而提高对脂筏特异识别的灵敏度与精准性；DLR的亲脂性长碳链（C8H17）可以显著提高其对脂筏的亲和力.

Scheme 1 Molecular structure of DLR

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

二油酰磷脂酰胆碱（DOPC）、二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、胆固醇（Cholesterol）和鞘磷脂（Sphingomyelin）购于西安瑞禧生物科技有限公司；甲基-β-环糊精（MβCD）购于淄博千汇生物科技有限公司；霍乱毒素B-Alexa 594［CTxB-Alexa 594（C594）］购于赛默飞世尔科技（中国）有限公司.

Varian Inova 400 MHz型核磁共振仪（1H NMR），美国Varian公司；HP 8453型紫外-可见分光光度仪(UV-Vis)，美国惠普公司；RF-5000型荧光分光光度仪，日本岛津公司；Spectra-max190型全波长酶标仪，美国Molecular Devices公司；GC-TOFMS(EI)型气相色谱-飞行时间质谱仪（EIMS），美国Waters公司；XT-4型双目显微熔点测定仪；HP1100LC/ESI-MSD型电喷雾质谱仪，美国Agilent Technologies公司；FT/IR-4700型傅里叶变换红外光谱仪（FTIR），扫描范围为350～7800 cm-1，KBr压片法，日本Jasco公司；Perkin2400(Ⅱ)型元素分析仪，美国Perkin公司；Mira 900-F型锁模飞秒钛蓝宝石激光器，美国Coherent公司.

1.2 实验过程

1.2.1 巨型单层囊泡的制备 参照文献［21］的电形成法制备巨型单层囊泡（GUVs）及DPPC+DLR，DOPC+DLR和DOPC/鞘磷脂/胆固醇（摩尔比1∶1∶1，Raft mix，也称模拟脂筏）+DLR 3种巨型囊泡，一般脂质浓度为1 mmol/L，脂质与探针的摩尔比为200∶1，工作液用氯仿/甲醇（体积比为9∶1）配制.

1.2.2 中间体2，3，4和5的合成 参照文献［22］方法合成化合物2和3，参照文献［23］方法合成化合物4和5（Scheme 2）.化合物2：白色针状晶体，m.p.73.5～75℃，EI-HRMS（C33H31N5S2计算值），m/z：263.9207（263.9571）；化合物3：白色针状晶体，m.p.210～212℃，EI-HRMS（C10H8N2计算值），m/z：156.0723（156.0687）；化合物4：白色粉末，m.p.126～127℃，EI-HRMS（C10H7BrN2计算值），m/z：233.9747（233.9793）；化合物5：白色晶体，EI-HRMS（C14H17N2O3P计算值），m/z：292.0977（292.0977）.

Scheme 2 Synthetic route of DLR

1.2.3 中间体7的合成 将5 g（30 mmol）咔唑和3 g（53.6 mmol）氢氧化钾加入盛有30 mL二甲基亚砜（DMSO）的100 mL干燥单口烧瓶中，将4 mL 1-溴辛烷置于恒压滴液漏斗中并安装于烧瓶上；将烧瓶置于80～85℃的油浴中，搅拌下滴入1-溴辛烷，反应3 h；冷却后加入100 mL蒸馏水混合，静置后有淡黄色固体析出，过滤，干燥；用无水乙醇重结晶，得到5.7 g中间体7白色针状晶体，收率68%，熔点68～70℃.1H NMR（CDCl3，400 MHz），δ：8.07（d，J=7.6 Hz，2H），7.43（t，J1=J2=7.6 Hz，2H），7.35（d，J=8.0 Hz，2H），7.20（t，J1=7.6 Hz，J2=7.2 Hz，2H），4.22（t，J1=J2=7.2 Hz，2H，NCH2），1.81（m，2H），1.28（m，10H），0.85（t，J1=6.4 Hz，J2=7.2 Hz，3H）（图S1，见本文支持信息）；13C NMR（400 MHz，CDCl3），δ：140.6，125.7，123.0，120.5，118.8，108.8，43.2，32.0，29.5，29.3，29.1，27.5，22.8，14.2（图S2，见本文支持信息）；MS（C20H25N1计算值），m/z：279.1987（279.1987）［M+］.

1.2.4 中间体8的合成 在冰水浴中，将6 mL干燥的二甲基甲酰胺（DMF）加入100 mL干燥单口烧瓶中，滴入5 mL三氯氧磷；准确称取4 g（14.3 mmol）中间体7溶于40 mL氯苯中，转移至恒压滴液漏斗内，并安装于烧瓶上；0.5 h后，将9-辛基咔唑的氯苯溶液缓缓滴入单口烧瓶中，在70～75℃的油浴中搅拌反应6 h；反应完全后冷却，用碳酸氢钠调节pH至中性，用氯仿萃取，再用无水硫酸钠干燥，减压脱去溶剂，用无水乙醇重结晶，得到4.17 g中间体8白色晶体，收率95%.1H NMR（400 MHz，CDCl3），δ：10.06（s，1H），8.55（s，1H），8.11（d，J=8 Hz，1H），7.91（d，J=8.4 Hz，1H），7.51（t，J1=J2=8 Hz，1H），7.41（d，J=8.4 Hz，2H），7.28（t，J1=J2=7.6 Hz，1H），4.26（t，J1=J2=7.6 Hz，2H），1.84（m，2H），1.28（m，10H），0.85（t，J1=J2=6.4 Hz，3H）（图S3，见本文支持信息）；13C NMR（400 MHz，CDCl3），δ：191.9，144.2，141.3，128.7，127.3，126.9，124.1，123.2，123.2，120.9，120.5，109.6，109.1，43.6，32.0，29.5，29.3，29.1，27.4，22.8，14.3（图S4，见本文支持信息）；MS（C21H25NO计算值），m/z：307.1938（307.1936）［M+］.

1.2.5 目标化合物DLR的合成 将446 mg（1 mmol）中间体8和30 mg（1.25 mmol）氢化钠置于25 mL干燥单口烧瓶中，将292 mg（1 mmol）中间体5溶于10 mL四氢呋喃中，转移至恒压加料器中，将恒压加料器装在单口烧瓶上，并抽真空用氩气保护；将烧瓶置于冰水浴中，在强烈搅拌和避光条件下，将中间体5的四氢呋喃溶液逐滴加入混合液中（滴加时间40～50 min）；滴加完毕后，室温搅拌反应24 h；反应结束后，抽真空脱除四氢呋喃（THF），用二氯甲烷萃取提纯（15 mL×3），用水洗涤（10 mL×3），用无水硫酸镁干燥，过滤，抽真空脱除溶剂.粗品经硅胶柱色谱分离［洗脱液：V（正己烷）∶V（乙酸乙酯）=12∶1］，得到303 mg（0.68 mmol）DLR黄色粉末，产率68%.1H NMR（400 MHz，CDCl3），δ：8.26（s，1H），8.14（d，J=7.2 Hz，1H），8.03（s，1H），7.72（d，J=8.8 Hz，1H），7.56（s，1H），7.49（t，J1=J2=7.2 Hz，2H），7.44（d，J=11.6 Hz，1H），7.39（d，J=10.4 Hz，1H），7.32（d，J=16.4 Hz，1H，CH=C H），7.26（d，J=16.4 Hz，1H，CH=C H），4.30（t，J1=J2=7.2 Hz，2H，NCH2），2.56（s，3H，CH3），1.88（m，2H），1.356（m，2H，NCH2C H2），1.32［m，10H，（CH2）5］，0.86（t，J1=J2=6.8 Hz，3H，CH2C H3）（图S5和S6，见本文支持信息）；13C NMR（CDCl3，100 MHz），δ：141.1，140.5，139.8，139.6，136.2，134.5，129.1，126.7，126.4，125.1，123.512，121.4，120.8，120.3，119.6，118.9，117.6，117.1，114.2，109.4，43.5，32.0，29.5，29.3，29.2，27.5，23.7，22.8，20.1，14.2（图S7，见本文支持信息）；MS（C31H31N3计算值），m/z：445.2518（445.2507）［M+］.

2 结果与讨论

2.1 溶剂极性对发射光谱的影响

DLR的最大吸收波长几乎不随溶剂变化（图S8和表S1，见本文支持信息），DLR的发射最大波长（λEM）与溶剂极性呈正相关，在环己烷（cHex）和二甲亚砜（DMSO）中分别为422和581 nm［图2（A）和表S1］，即随着溶剂极性经验参数π*［24］递增，具有宽广的溶剂生色范围，即从422 nm（环己烷）到581 nm（DMSO）.DLR在cHex中只有400～480 nm处的定域激发（LE），在DMF与DMSO中于400～480 nm处的定域发射强度远小于480 nm以上区域（＞480 nm）的离域激发（DE）的发射强度，而在THF中则没有显示LE峰.DLR的发射强度按DPPC，Raft mix和DOPC的顺序显著减弱，强度比例为20∶12.8∶1，且有较小的红移［图2（B）］.DPPC与DOPC分别类似于脂筏（lo）和甘油磷脂（ld），表明DLR在lo中的荧光强度远大于ld中的，亲脂性长碳链C8H17赋予DLR很强的脂相容性，因此，DLR可用于脂筏的识别检测.

DLR属于D-π-A型分子（D为电子供体，A为电子受体，π为共轭桥，此处为C=C），在激发态时伴随分子的供体端与分子主体间的扭转，发生电荷分离，即电子从供体端咔唑氮原子上迁移至氰基端，形成部分的偶极.极性介质有利于偶极电荷分散，稳定偶极状态，亦即偶极激发态能量降低，相应发出能量较低的荧光，表现为发射波长红移.由于非偶极激发态跃迁至偶极激发态是一个非辐射跃迁，发生能量衰减甚至坍陷，因此，荧光强度自然减弱.

Fig.2 Normalized(A)and relative(B)emission spectra of DLR in various solvent(A)Arranged in the order of increasingπ*value were 0,0.58,0.88,1.00 in cHex,THF,DMF,DMSO,respectively,as empirical parameter of solvent polarity.

2.2 双光子发射截面与激发波长的关系

参照文献［25，26］方法测定DLR的双光子发射截面和激发波长，结果示于图3，图S9和表S1（见本文支持信息）.可见，Φδ按DPPC，Raft mix和DOPC的顺序递减，分别为1350，975和67 GM，是已报道的同类探针中双光子发射截面最大的［13～17］；最大双光子激发波长（λTPEM）分别为780，790与800 nm.可见，当介质极性增大时Φδ减小，DPPC中的Φδ是DOPC中的20多倍，因此DLR足以区分lo（类似于DPPC）和ld（类似于DOPC）.这归功于激发态分子在极性较大介质中（或较小黏度介质中）发生分子内扭转，分子共平面性减弱，导致Φδ减小.

Fig.3 Two-photon action spectra of DLR(c=1μmol/L)in DPPC(a),raft mixture(b)and DOPC(c)n(lipid)∶n(DLR)=100∶1,these data were measured at(25±0.5)℃.

2.3 时间分辨荧光谱

参照文献［17］方法测定时间分辨荧光谱（TRFs），结果见图4和表S2（本文支持信息）.探针DLR在DPPC和细胞中的荧光寿命（3.6～4.5 ns）均大于在DOPC中的（1.7～1.9 ns）（表S2中的τ3），且超过1倍（≥4.1/1.9≈2.2），这归因于刚性平面分子DLR在刚性脂筏中难以发生激发态分子扭转而荧光衰减较弱；在DOPC中的LE态的时间衰减常数为65 ps（支持信息表S2中的440 nm处对应的τ1）；而DE态的则为21 ps（表S2中的580 nm处对应的τ1），前者是后者的3倍以上.以上数据表明，DLR在DOPC中的荧光很弱，且强度衰减迅速.因此，无论是荧光强度还是荧光寿命，都随介质极性递减.细胞中的TRFs与Raft mix中的很相似，表明DLR的荧光能清晰地将凝胶相（脂筏lo）和流体相（甘油磷脂ld）区分开，这源于DLR对凝胶相的亲和力远大于对流体相的，且极性介质中的荧光更弱.

2.4 双光子荧光成像

DLR标记的GUVs（DPPC，Raft mix和DOPC）在790 nm激光激发下可获得TPM图像（图S10，见本文支持信息），显示出斜向上方向的弱荧光区域.由图S10可知，荧光强度按DPPC，Raft mix和DOPC的顺序依次减小，特别是DOPC中的荧光强度相当微弱，表明荧光强度与脂质体极性呈负相关，且DLR更易亲和DPPC，亦即更易与lo结合.

为了进一步验证和了解DLR识别检测脂筏的可行性及相应的应用性能，将其应用于细胞与组织成像研究.小鼠成纤维细胞的培养［27］与小鼠脑组织切片的制备［28］均参照文献方法操作.小鼠成纤维细胞成像结果如图5（A）～（D）所示，可以看出，在未加MβCD时，细胞脂筏区域显示较强的荧光强度，强度越大的细胞区域的脂筏含量越高［图5（A）］；当加入MβCD处理细胞后，细胞脂筏区域荧光变得微弱，原来荧光较强的细胞区域甚至难以看到荧光［图5（C）］，这是由于MβCD为脂筏抑制剂，能破坏胆固醇和磷脂，从而破坏细胞中的脂筏，脂筏含量显著减小，荧光相应大大减弱；当再用胆固醇（50μmol/L）处理细胞后，荧光强度又几乎恢复到加入MβCD前的状态［图5（D）］.这些现象证明DLR能够用于检测细胞质膜中的脂筏.

Fig.4 Time resolved fluorescence of DLR in DPPC(A),DOPC/sphingomyelin/cholesterol(molar ratio:1∶1∶1)(B),DOPC(C)and cell(mouse fibroblast)(D)

Fig.5 Pseudo colored TPM images of 1.0μmol/L DLR(A,C,D),5.0μmol/L DLR(E,G,H),1.0μmol/L C594(B)and 5.0μmol/L C594(F)-labelled mouse fibroblast/mouse brain tissue slices before(A,E)and after(C,G)treatment with 10 mmol/L MβCD for 30 min at 37℃,respectively(D,H)TPM images of mouse fibroblast after repletion with 50μmol/L cholesterol for 1 h at 37℃and the removal of the remaining cholesterol.The TPEF images were collected at 450—550 nm upon excitation at 790 nm with fs pulses.

为了验证探针DLR对脂筏的特异性亲和，用DLR与商业化公认的脂筏探针C594分别标记细胞，进行成像对比研究.结果表明，C594标记的细胞的荧光只是零星地分布且比较暗弱［图5（B）］，而DLR标记的细胞［图5（A）］不但荧光强、细胞膜轮廓清晰可见，而且有些荧光区域是C594标记的细胞所不具有的，说明某些脂筏区域C594根本感应不到，其对脂筏的特异性比DLR的特异性低.图5（E）～5（H）给出组织成像结果，其情况与细胞成像类似.当鼠脑组织切片用DLR孵育后，发出强烈的荧光［图5（E）］，不同组织区域荧光强度差别较大，反映出脂筏浓度的非均匀分布；当加入MβCD处理后，荧光强度急剧减弱［图5（G）］，表明脂筏绝大部分被破坏；当加入胆固醇后荧光几乎恢复到未加入MβCD时的状态［图5（H）］，证实DLR能成像组织中脂筏的分布动态.为进一步证明DLR对脂筏的特异性识别，用DLR与C594分别对鼠脑组织切片染色.对比图5（E）与（F）可知，DLR染色切片的荧光比C594染色的要强得多，C594染色的切片照片缺失部分荧光区域［图5（F）］，而这些缺失的区域在DLR染色的切片中清晰可见［图5（E）］.此结果再次证明组织中某些区域的脂筏不被C594感应，其对脂筏的特异性低于DLR，DLR优良的特异性也是亲脂性长碳链C8H17与分子整体构造的结果.DLR探针与脂筏主成分胆固醇均为4个碳环（1个五元环和3个六元环）的 D-π-A型分子，体现出高度平面刚性.

3 结 论

衍生于咔唑的双氰基二苯代乙烯型双光子荧光脂筏探针（E）-2-甲基-5-｛2-［9-辛基（3-咔唑基）］乙烯基｝对苯二甲腈（DLR）显示出双光子吸收、对脂筏的特异性亲和及生物成像等优良性能，其双光子发射截面在二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）中高达1350 GM，且荧光强度随介质极性递减，而最大发射波长却随溶剂极性递增.DLR在DPPC中的发射强度是二油酰磷脂酰胆碱（DOPC）中的20倍，在DPPC中的荧光寿命是DOPC中的2倍多.DLR能够很好地识别脂筏，成像脂筏在细胞与组织中的分布动态.DLR探针的优良性能首先得益于双氰基二苯代乙烯的高双光子吸收的分子架构，咔唑的大平面共轭体系对探针的双光子吸收亦发挥了不小的贡献；其次是探针与脂筏主成分胆固醇均属D-π-A型分子，且都有4个碳环（1个五元环与3个六元环），探针为稠环，胆固醇为桥环，都具高度平面刚性.此外，因探针与脂筏主成分胆固醇均有1条含8个碳原子的脂肪长链，引入1个柔性正辛基不但有助于提高探针对脂筏的特异性亲和能力，而且能提高探针对细胞膜脂双分子层的吸附渗透.这些策略为开发新的脂筏探针提供了借鉴经验，亦丰富了双光子荧光探针的设计理论.

支持信息见http：//www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20210140.