核桃凋落叶分解对豌豆生长及抗性生理的影响

高 洪

(凉山州林业调查规划设计院，四川 西昌 615000)

自20世纪70年代以来，全球人口剧增，资源过度消耗，人类面临着生态环境恶化、土地资源减少的紧迫形势，环境和发展成为当今国际上的两大重要论题。作为具有可持续发展特点的土地利用和经营方式，农林复合系统日益受到人们的重视[1]。果树具有较高的经济价值，深受农民喜爱，果农间作成为了农林复合系统的主要模式之一[2]。但是农林复合系统中植物之间普遍存在着相互影响的现象，其主要现象之一就是化感作用，其影响着复合系统的生态功能和经济效益，近年来已成为世界各国科学家重视的一个新研究领域[3]。

核桃(Juglan regia)又名胡桃，属胡桃科(Juglandaceae)核桃属(Juglans)植物。核桃具有营养价值高、木材珍贵等优点，已成为广大农民造林的首选树种之一[4]。但是多项研究表明[5-11]，核桃的叶、果皮及根皮分泌释放的次生代谢物质及衍生物对林下作物可能具有毒害作用。核桃分泌释放的化感物质主要由黄酮和酚类组成[12,13]。人们对化感的研究起步虽早，但是前期的研究方法基本停留在采用浸提液进行室内发芽试验和幼苗期生长的测定上。近年来，出现了盆栽试验的生物测试方法[14,15]，即通过盆栽试验，让凋落叶在种植有作物的土壤中自然分解，观察其在分解过程中对受体作物生长、生理的影响，从而了解其产生的效果并探讨其作用机理，具有一定的实践意义，是迄今为止更接近生产实践的一种实验生态学研究方法。本试验拟采用常见作物豌豆(Pisum sativum)作为受体，通过盆栽试验探讨核桃凋落叶在自然分解过程中对豌豆生长的影响，初步了解核桃对豌豆的化感作用，分析核桃与豌豆的种间关系，以期为核桃与豌豆以及类似作物林农复合种植模式的发展与合理经营提供理论依据和技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供体材料

供试核桃凋落叶取自四川省凉山州西昌市郊区十年生核桃当年凋落叶。

1.1.2 受体材料

供试豌豆为适宜当地的同1株长势优良的豌豆。

1.1.3 栽植土壤与容器

选择当地农田砂壤土，每盆用土10kg，播种前将土壤与凋落叶碎末均匀混合，再装入口径30cm、高度30cm的塑料盆钵。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计

本试验采用盆栽的方法进行，具体方法是按设计的凋落叶量，将凋落叶碎末与土壤均匀混合装盆，在其中播种豌豆。

采用野外随机4m×4m样方调查的方法，推算得到本试验所用盆钵盆口面积的核桃林地面积上每年约凋落80g核桃凋落叶，故以80g每盆作为基本施入量。并采用0.5倍、1倍和2倍处理，即凋落叶用量分别为40g、80g和160g，对照T0不施凋落叶，各凋落叶处理和T0均设5盆重复。

播种时，将处理好的豌豆种子点播于盆中，保证每盆种子数量基本相同并且在盆中分布均匀，覆土2cm，浇透水。待豌豆发芽后进行常规的田间管理。

1.2.2 指标测定及方法

本试验的播种时间为10月25日，播种30d后对全部豌豆进行破坏性取样，测定每盆平均株高、主根长及其生物量，并每盆随机取新鲜叶片1g测定其抗性生理指标。其中，超氧化物歧化酶(SOD)活性测定采用氮蓝四唑法[16]；过氧化物酶(POD)活性测定参照愈创木酚法[17]；过氧化氢酶(CAT)活性测定参照紫外分光光度法[18]；丙二醛(MDA)与可溶性糖(SS)含量测定采用硫代巴比妥酸加热显色法[17]；脯氨酸(Pro)含量测定采用电位滴定法[17]；可溶性蛋白(SP)含量测定采用考马斯亮蓝G250法[17]。

1.2.3 数据处理分析

用Willamson和Richardson[19]提出的敏感指数RI为衡量指标对核桃凋落叶对豌豆的化感效应进行度量，即：

RI=1-C/T(当T≥C时)或RI=T/C-1(当T

式中，T为处理值；C为对照值；RI>0表示促进作用，RI<0表示抑制作用，RI的绝对值代表化感作用强度的大小。

利用SPSS 17.0(SPSS Inc.,USA)分别对数据进行One-way ANOVA分析，如果差异显著(P<0.05)，再用LSD进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 核桃凋落叶在土壤中分解对豌豆形态指标的影响

由表1可知，各核桃凋落叶处理豌豆的株高、地上部分鲜重、地下部分鲜重均显著低于对照(T0)，不同凋落叶处理之间形态指标的差异不明显。

表1 不同量核桃凋落叶处理对豌豆形态指标的影响

2.2 核桃凋落叶在土壤中分解初期对豌豆3种抗性指标及MDA含量的影响

表2 不同量核桃凋落叶量处理对豌豆的抗氧化酶系统的影响

根据表2可知，凋落叶在土壤中分解降低了豌豆叶片SOD、CAT活性，各凋落叶处理SOD、CAT活性均显著(P<0.05)低于T0，出现了T0>T1>T2>T3的现象；各凋落叶处理POD活性显著(P<0.05)低于T0，各处理之间差异不明显且无明显变化趋势。综合化感指数来看，SOD活性化感指数为-0.135～-0.340，POD活性化感指数为-0.350～-0.452，CAT活性化感指数为-0.312～-0.430，由此可推断SOD活性下降程度低于POD、CAT活性。受到核桃凋落叶分解的作用后，豌豆叶片MDA含量呈现上升趋势，见表3，表明豌豆已经受到伤害。

表3 不同量核桃凋落叶量处理对豌豆的MDA含量的影响

2.3 核桃凋落叶在土壤中分解对豌豆3种渗透调节物质的影响

由表4可知，各凋落叶处理的脯氨酸(Pro)、可溶性糖(SS)2种渗透调节物质的含量均高于对照(T0)，且各凋落叶处理与T0之间差异均达到显著水平(P<0.05)，同时出现了各处理之间差异不显著(P>0.05)的现象。各凋落叶处理SP含量与Pro、SS表现相反，各凋落叶处理SP含量均呈现低于T0的现象，且差异显著(P<0.05)。总体来看，各凋落叶处理呈现出Pro和SS下降，SP上升的趋势。

表4 不同量核桃凋落叶处理对豌豆的3种渗透调节物质的影响

3 讨论

早在1937年，Molish就提出了植物在生长或腐烂过程中释放出对邻近植物生长有干扰作用的次生代谢物为化感物质的观点，并发现了核桃树叶可释放出后被命名为胡桃醌的5-羟基萘醌，其对草本和禾本科(Poaceae)植物有剧毒作用。本研究结果表明，核桃凋落叶在土壤中分解对豌豆的化感作用非常明显。孙墨龙[20]等利用GC-MS气质联用仪鉴别出核桃楸树叶中有醌类、酚类、脂类、酮类等物质，其中醌类、酚类等大多数物质均被证实对植物、微生物和昆虫具有不同程度的作用。“腐烂释放”是化感物质进入环境的主要途径之一[21]，在生产过程中是常见的，同时也是可以避免的。许多化感物质被释放到土壤后并未溶解，受到土壤中的微生物、土壤酶等物质影响后形成新的化感物质[15,22]。如，核桃叶中含有的羟基胡桃苷在土壤中会转化为胡桃醌。由此推断，本试验中豌豆的形态和生理所受到的影响是核桃凋落叶自身所含的化感物质以及在土壤中衍生的化感物质共同作用的结果。

在本试验中，核桃凋落叶的分解造成了豌豆叶片3种保护酶(SOD、POD、CAT)活性的降低，同时膜脂过氧化产物MDA含量上升。这是因为当植物受到胁迫时，其体内的O2-、H2O2等ROS(活性氧)含量将会增加，而积累的具有强氧化性的ROS首先攻击膜系统，膜脂脂肪酸中的不饱和键被过氧化，即使细胞发生膜脂过氧化，损伤细胞产生MDA[23]。植物通过长期进化，建立起来一套针对ROS的防御系统。ROS作为一种有害物质的同时也作为一种胁迫信号，刺激植物体内抗逆基因的表达，使3种保护酶活性被诱导升高，其中SOD可歧化O2-成H2O2，POD和CAT则均能使H2O2分解成无毒的H2O和O2，从而阻止或降低ROS对膜的伤害。但是当胁迫强度过高时，ROS积累过于迅速，酶活性自身受到抑制甚至钝化将导致无法有效清除ROS和保护细胞[15,24]。综合来看，核桃凋落叶分解产生的化感物质对豌豆产生的影响已经超出了豌豆保护酶系统可以调控的范围，豌豆已经受到比较明显的伤害。本试验结果与Lu Z G等对小麦[25]的研究结果一致。但并未出现Zhang F J等对水稻[26]，ZUO S P等对土豆(Solanum tuberosum)[27]，张维昊对藻类[28]的研究发现的现象。也并未出现李锋民等[29]、金瑞等[30]研究所发现的低促高抑现象。这可能是因处理方式和时间不同所致。

当植物受到水分胁迫，渗透调节物质如脯氨酸(Pro)、可溶性糖(SS)、可溶性蛋白(SP)将被大量诱导合成。这些渗透调节物质具有维持细胞正常膨压的功能，除此之外，Pro还可以螯合单线态氧高效清除羟自由基从而清除活性氧以及保护蛋白质、生物膜、亚细胞结构，进而保护植物细胞免受逆境胁迫伤害[31,32]。作为细胞渗透调节的主要贡献者，SS对胁迫下的细胞结构还具有保护作用[33]。本试验发现，各处理Pro、SS含量明显高出T0，SP含量低于T0。这可能是因为抗氧化物酶系统代谢紊乱，导致细胞内H2O2大量积累，先激活Pro合成的谷氨酸途径再激活鸟氨酸途径，同时抑制Pro降解途径，促进渗透调节物质Pro积累量增大[34]。Pro的积累诱导了SS加速合成[35]。逆境条件下，植物体内由于蛋白质等大分子化合物降解成为了SS等物质[36]，SS含量上升，水分胁迫使蛋白质的合成受到抑制[37]，蛋白酶活性的提高加快了蛋白质的水解，同时RNA转录和翻译受到抑制，造成SP含量减少[39]。这与朱慧等对几种牧草[38]、杨梅对杉木[39]、陈绍莉对茄子(solanum melongena)[40]的研究结果基本一致，与薛金辉[41]发现的Pro含量下降的研究结果不一致。这可能是因为不同物种对化感物质的响应、承受程度的不同所导致。此次试验并未体现出明显的浓度依赖，且各项指标随凋落叶施入的变化趋势，在各次测定中的差异较以往差异大[15]。这可能是因为将凋落叶粉碎后加入土壤，加速了化感物质的释放且凋落叶释放的化感物质大多不溶于水，从而导致各处理土壤溶液中的主要有毒物质均处于饱和状态，差异不大。又因粉碎加速了化感物质的释放和分解，所以3次测定各项指标随凋落叶的施入的变化趋势差异较其它研究大。

本研究结果表明，核桃凋落叶在土壤中分解过程中显著抑制了豌豆株高、根长、地上部分鲜重、地下部分鲜重。这与安玉艳等[42]的研究结果基本一致。这可能是因为化感作用造成豌豆吸收和运输水分的能力降低。为了满足水分的需求，将生长中心向根系转移，以便从土壤中吸收更多的水分用以维持生存。

4 结论

综合各项研究结果表明，核桃凋落叶在土壤中分解，初期对豌豆造成的胁迫其能够通过自身保护系统进行调节，但是当核桃凋落叶分解到中后期，化感物质对豌豆细胞膜脂造成了较严重的损害，可能进一步影响豌豆对水分等营养物质的吸收和运输，生长受到抑制。所以核桃对豌豆具有明显的化感抑制效应，从而推断豌豆不适于与核桃进行间作。