染料厂遗址土壤中微生物的筛选鉴定及理化性质分析

吴玉清王永会李祥宋新贺李媛罗辑赵远

(1.鸿灌环境技术有限公司，江苏 苏州 215200；2.苏州市吴江生态环境局，江苏 苏州 215200；3.常州大学环境与安全工程学院，江苏 常州 213164)

近年来，随着工业的快速发展，人口的急剧增加，土壤污染日益严重，包括固体、液体污染物向自然界堆放和排放现象严重，有害的废水渗透，以及随雨水落入土壤的有害物质[1]。其中染料污染尤为突出，这些污染影响微生物的生命活动，导致土壤系统因能量流动变慢而不断恶化，同时部分有害物质由富集作用进入人体间接影响人的身体健康。目前，染料污染已成为世界公害之一，每年全世界有大量染料垃圾进入环境，污染土壤、地下水、河流和海洋。染料对土壤的污染主要是有机物染料在土壤中能够长期残留，破坏土壤结构，影响土壤通透性[2]。同时，污染物会进入食物链最终危及人类健康。染料污染物在自然界很难被有效降解，传统的物理化学方法不仅操作麻烦，投资巨大，处理效率低下，且存在二次污染，而微生物处理污染物技术具有处理速度快、消耗低、效率高、成本低、反应条件温和且无二次污染等显著优点[3]，加之其技术开发具有广阔的市场前景，各国政府、科研工作者和企业家对此高度重视，而且目前对降解染料污染物的菌类研究较少，因此筛选染料厂遗址土壤中的微生物具有重要意义。

本次研究取样于江苏省泰兴市黄桥镇南沙社区染料污染遗址土壤，该区域为《土壤污染防治行动计划》拟在全国启动200个土壤污染治理修复试点示范项目的先期启动试点项目区域。该区域由于长期工业生产活动，土壤中多种重金属明显累积并超过背景水平和相关标准。项目区染料等固废处置和废水排放，导致周边耕地、农田地灌溉水源地河道和水体受污染，土壤和灌溉水污染直接威胁着农产品质量安全，危害人体健康，该项目的开展刻不容缓。

1 土壤微生物分离、纯化

土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某些微生物的特征则需要把目的菌从混杂的微生物中分离出来，这种获得单一纯培养的方法称为微生物的分离与纯化[4]。微生物代谢速度快，容易变异，因此在分离纯化后需要进行菌株保存。

最常用的方法是稀释涂布法和平板划线法。如果需要分离的微生物在微生物群体中的数量较少或生长过慢，则需要使用选择培养基，通过改变微生物在群体中的比例达到筛选的目的[5]。

本实验将从染料厂遗址不同地方3份土样(2份染料出口下方土样和1份垃圾堆附近土样)中筛选出几株特征明显的不同种类的纯培养并进行菌种的保存。

1.1 实验方法

本实验是筛选纯化染料厂遗址土壤微生物，得到微生物的纯培养，主要是在稀释涂布法的基础上进一步使用平板划线法得到单一菌落。

1.2 实验结果与分析

通过传统的筛选方法共筛选得到11株纯培养。3个土样(E2、E3、E4)经梯度稀释涂布分离得到菌落形态可知，在同等培养条件下，E3土样内微生物含量低于E2和E4。进一步平板划线培养，得到11株形态差异较大特征明显的纯培养，对应其采集土壤分别编号为E21、E22、E23、E24、E31、E32、E33、E41、E42、E43和E44，其特征如表2。其中几种菌(E21、E33、E42)平板划线后培养得到的菌落形态如图1～3所示。

由实验结果可以看出，在每个培养基中，划线的最后部分均有单个菌落出现，即说明分离纯化得到了纯培养。

2 革兰氏染色

革兰氏染色法[6](Gram stain procedure)是1884年丹麦病理学家Christain Gram创立的，之后在一些学者不断改进下成为细菌学中最重要的鉴别染色法。革兰氏染色的目的是判断分离、纯化的土壤菌为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌，同时可以通过染色观察菌的微观性质。

2.1 实验方法

土壤经梯度稀释涂布、划线分离、纯化实验得到菌落特征差异较大的11种土壤细菌，革兰氏染色，数码生物显微镜下观察、拍照并记录结果。

2.2 实验结果与分析

通过革兰氏染色实验得出11株菌的性质。经梯度稀释涂布、划线分离、纯化实验得到菌落特征差异较大的11株菌株细胞经革兰氏染色后，在数码生物显微镜下观察拍摄照片，细菌形态如图4～14所示。

由拍摄照片可看出，11株菌均被染成紫色，说明此次筛选得到的细菌均为革兰氏阳性菌(G+)。进一步观察发现，E21为两端半圆形的杆菌，有居中不膨大的芽孢，存在细胞荚膜，成对排列；E22为弧菌，无芽孢，也不存在细胞荚膜，单个排列；E23为单个或成对排列的椭球形菌，存在荚膜，无芽孢；E24为两端半圆形的链杆状菌，有荚膜，无芽孢存在；E31为单个或成对排列的椭球形菌，有荚膜存在，无芽孢；E32为有荚膜，无芽孢，多个排列在一起呈链状的椭球形菌；E33为两端略尖形，无荚膜，无芽孢的棒杆状菌；E41为多个排列在一起呈链状的有荚膜无芽孢的球菌；E42为有荚膜，无芽孢，单个或成对排列的球形菌；E43为椭球形菌，多个不规则排列在一起，但非链状，有荚膜，无芽孢；E44为有荚膜，无芽孢，单个过成对排列的椭球形菌[6]。

3 生理生化实验

传统的微生物鉴定方法就是利用其生理生化特性，且微生物的生理生化特征能够表明该微生物在某些方面的特性，而这些特性能够为其实际应用提供参考价值。

3.1 甲基红(M·R)实验

微生物在生长代谢过程中将葡萄糖分解为丙酮酸，有些微生物能够进一步将丙酮酸转化为甲酸、乙酸等，使pH降低，当pH低于4.2时，加入甲基红指示剂，若变为红色，则该菌为甲基红阳性菌；如微生物分解葡萄糖产酸量少或不产酸，培养基pH在5.4以上，加入甲基红指示剂呈桔黄色或不变色，则该菌为甲基红阴性菌[7]。

通过甲基红试验得出11株菌的产酸性。培养的菌液及空白对照培养基加入白色比色瓷盘内，滴加适量甲基红指示剂后，E21、E22、E23、E31和E33与对照组对比颜色无变化；E32和E43在滴加指示剂后变为橙黄色；E24、E41、E42和E44表现为红色。部分结果如图15～17所示，其中1为实验组，2为对照组。

根据实验结果可知，E24、E41、E42和E44为甲基红阳性，其余为甲基红阴性。

3.2 过氧化氢酶实验

某些微生物中含有过氧化氢酶，能催化H2O2分解成H2O和O2而有气泡产生，由此反应可知受检菌是否含有过氧化氢酶[8]。

通过过氧化氢酶试验得出菌的过氧化氢酶性质。向11株菌苔上滴加30%H2O2后，E21、E32、E41和E42明显产生气泡，说明这几种菌皆含有过氧化氢酶，即为过氧化氢酶阳性；其余E22、E23、E24、E31、E33、E43和E44不产生气泡，说明这几种菌不含有过氧化氢酶，为过氧化氢酶阴性。

3.3 氧化酶实验

氧化酶在有分子氧及细胞色素C存在时可氧化盐酸对氨基二甲基苯胺，使之呈玫瑰红到暗紫红色。由此反应可知受检菌是否具有细胞色素氧化酶[8]。

通过检验试纸得出氧化酶性质。挑取受检菌于氧化酶试纸上，观察发现，E21、E22、E24、E31、E32、E33、E41、E42和E44在10s变红，说明这些菌均为氧化酶阳性菌，其余的E23和E43为显示红色，表明这些菌为氧化酶阴性菌。

3.4 实验结果与分析

经过甲基红实验、氧化酶试验以及过氧化氢酶试验结果可得出11株纯培养的生理生化性质，结果如表2所示。

表2 生理生化性质

结合细菌筛选后得到的菌落特征，革兰氏染色特征以及生理生化试验结果，查阅《常见细菌系统鉴定手册》对得到的菌株进行传统方法的鉴定，可以得出，E21可能为巨大芽孢杆菌属；E22为弧菌；E23可能为乳球菌属；E24可能为球杆菌属；E31可能为孪生球菌属；E32可能为盐水球菌属；E33可能为微小杆菌属；E41可能为糖球菌属；E42可能为嗜热糖球菌；E43可能为片球菌属；E44可能为明串球菌属[9]。

4 总DNA的提取

为了将分离、纯化出的E21、E22、E23、E24、E31、E32、E33、E41、E42、E43和E44 11种菌进行鉴定及进一步研究。使用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取分离、纯化得到的11株细菌的总DNA，利用琼脂糖凝胶电泳确定提取效果。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应使不同大小的DNA分子迁移速度不同而分层，把分子量标准参照物和样品一起进行电泳即可达到检测的目的[10]。

通过DNA提取试剂盒提取得到11株菌的DNA，将提取DNA的进行琼脂糖凝胶电泳采用凝胶成像系统在紫外灯下观察拍照，如图18所示。

其中，0泳道为NormalRunTM 250bp-Ⅳ DNA ladder产生的跑胶条带，1～11泳道分别为E21、E22、E23、E24、E31、E32、E33、E41、E42、E43、E44的DNA跑胶条带，其中8和9电泳条带清晰，说明土壤菌E41和E42提取得到的DNA纯度较高，其余均有或明或暗的条带，说明其它菌提取得到的DNA可能含有杂质或者提取得到的DNA的量较少，由DNA maker提供的碱基对数可知，此次提取的DNA亮度条带位置在15000bp左右。

5 细菌菌属的鉴定

为了进一步确定筛选得到的微生物的菌属，从染料厂遗址土壤中分离得到特征明显的11株细菌(编号分别为E21、E22、E23、E24、E31、E32、E33、E41、E42、E43、E44)，在经过传统方法鉴定后，进一步采用分子生物学鉴定方法来明确其中几株细菌的种属。

通过PCR扩增的多个循环，将DNA由少量指数式增长得到大量DNA，通过DNA监测公司测序得到碱基序列，登陆http://www.ncbi.nlm.nih.gov，将基因序列与BLAST数据库中序列进行序列分析比较，同时用MEGA5软件，构建Neighbor-Joining树，确定菌属[11]。

通过PCR扩增DNA，对其进行琼脂凝胶糖电泳实验，紫外灯下拍摄照片，结果如图19所示。其中，0泳道对应为DNA maker 跑胶后产生的条带，1～11泳道分别对应PCR扩增E21、E22、E23、E24、E31、E32、E33、E41、E42、E43、E44的DNA跑胶后产生的条带。由图片可知，11株DNA的PCR扩增产物的凝胶电泳条带清晰，对应位置约在200bp左右，为DNA的基因片段[12]。

将其中的E21、E42进行测序，得到其基因片段序列。登陆序列比对网站NCBI，将E21和E42的基因片段序列与BLAST中的16srDNA序列进行序列分析比对，并与GenBank中已发表的16srDNA序列进行同源性比较，结果见表3、4。

表3 菌株E21的16s rDNA序列BLAST结果

表4 菌株E42的16s rDNA序列BLAST结果

取得E21和E42的DNA相关序列的登记号和对应的碱基序列，利用MEGA5构建系统进化树，结果如图20、21所示。

由图20中E21系统进化树可知，E21菌株和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)亲缘关系较近，与芽孢杆菌sp.B-jedd、sp.MT2及sp.FF4(Bacillus sp.B-jedd and Bacillus sp.MT2 and Bacillus sp.FF4)、psy芽孢杆菌(Bacillus psychrosaccharolyticus)有一定的亲缘关系，与新种芽孢杆菌FJAT-14515(Bacillus cihuensis strain FJAT-14515)、中度嗜盐菌BH030062(Pontibacillus chungwhensis BH030062)等亲缘关系较远[13]。

由图21中E42系统进化树可知，E42菌株和泛菌属(Pantoea spI12)亲缘关系较近，与肠杆菌属(Enterobacter sp.FF18)有一定的亲缘关系，与芽孢杆菌sp.HB-2(Bacillus sp.HB-2)等亲缘关系较远。

根据分子生物学方法得到结果表明，E21与巨大芽孢杆菌亲缘关系较近，与传统鉴定方法得到结果一致；E42与泛菌属亲缘关系较近，与传统方法鉴定结果为嗜热糖球菌有一定出入，因为传统方法鉴定具有一定的局限性。

6 结论

本实验通过对泰兴某染料厂遗址土样筛选纯化共得到11株纯培养。分别对这些纯培养进行革兰氏染色及几种传统的生理生化性质分析，提取DNA并用分子生物学的方法对其中几种进行同源性分析，鉴定菌属，为研究微生物治理修复染料污染提供实验经验。

通过传统的微生物筛选方法从3份土壤中共筛选、分离纯化共得到11株特征明显的细菌纯培养。通过革兰氏染色实验得到菌的微观特征及革兰氏性质，结果表明，E21、E33为短杆状革兰氏阳性菌，E22为长杆状革兰氏阳性菌，E23、E24、E31、E32、E43、E44为椭圆形革兰氏阳性菌，E41、E42为圆形革兰氏阳性菌。

通过几种生理生化反应对这些纯培养进行分析。氧化酶试验结果显示，E41、E21、E24、E31、E32、E33、E41、E42、E44为氧化酶阳性，E22、E23、E43为氧化酶阴性；甲基红试验结果得出，E24、E41、E42、E44为甲基红阳性，E21、E22、E23、E31、E32、E33、E43为甲基红阴性；过氧化氢酶试验结果表明，E21、E32、E41、E42为过氧化氢酶阳性，E22、E23、E24、E31、E33、E43、E44为过氧化氢酶阴性。

通过传统方法，查阅《常见细菌系统鉴定手册》，对得到的菌株进行传统方法的鉴定，可以得出，E21可能为巨大芽孢杆菌属；E22为弧菌；E23可能为乳球菌属；E24可能为球杆菌属；E31可能为孪生球菌属；E32可能为盐水球菌属；E33可能为微小杆菌属；E41可能为糖球菌属；E42可能为嗜热糖球菌；E43可能为片球菌属；E44可能为明串球菌属。

通过分子生物学技术成功鉴定了2株菌株。对提取得到11株菌的DNA进行PCR扩增，选择其中2个扩增后的产物送去基因公司测序，与NCBI中数据库比对，利用MEGA5构建系统树，发现E21和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)亲缘关系最近，E42与泛菌属(Pantoea sp.I12)亲缘关系最近。